Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Modellering av ligander till kartor härledda från elektronkryomikroskopi

Published: July 19, 2024 doi: 10.3791/66310
Automatic Translation
*1, *2, 1
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll introducerar de verktyg som finns tillgängliga för modellering av småmolekylära ligander i kryoEM-kartor av makromolekyler.

Abstract

Att dechiffrera protein-ligandinteraktionerna i ett makromolekylärt komplex är avgörande för att förstå den molekylära mekanismen, underliggande biologiska processer och läkemedelsutveckling. Under de senaste åren har kryogen provelektronmikroskopi (cryoEM) dykt upp som en kraftfull teknik för att bestämma makromolekylers strukturer och för att undersöka sättet för ligandbindning vid nära atomär upplösning. Att identifiera och modellera icke-proteinmolekyler i cryoEM-kartor är ofta utmanande på grund av anisotrop upplösning över molekylen av intresse och inneboende brus i data. I den här artikeln introduceras läsarna till olika programvaror och metoder som för närvarande används för ligandidentifiering, modellbygge och förfining av atomkoordinater med hjälp av utvalda makromolekyler. Ett av de enklaste sätten att identifiera närvaron av en ligand, som illustreras med enolasenzymet, är att subtrahera de två kartorna som erhållits med och utan liganden. Den extra densiteten hos liganden kommer sannolikt att sticka ut i skillnadskartan även vid ett högre tröskelvärde. Det finns fall, som visas i fallet med metabotropisk glutamatreceptor mGlu5, då sådana enkla differenskartor inte kan genereras. Den nyligen introducerade metoden för att härleda Fo-Fc utelämna-kartan kan fungera som ett verktyg för att validera och demonstrera närvaron av liganden. Slutligen, med det välstuderade β-galaktosidaset som exempel, analyseras effekten av upplösning på modellering av ligander och lösningsmedelsmolekyler i cryoEM-kartor, och en utblick över hur cryoEM kan användas i läkemedelsutveckling presenteras.

Introduction

Celler utför sina funktioner genom att utföra otaliga kemiska reaktioner samtidigt och oberoende, var och en noggrant reglerad för att säkerställa deras överlevnad och anpassningsförmåga som svar på miljösignaler. Detta uppnås genom molekylär igenkänning, vilket gör det möjligt för biomolekyler, särskilt proteiner, att bilda transienta eller stabila komplex med andra makromolekyler såväl som små molekyler eller ligander1. Således är protein-ligandinteraktioner grundläggande för alla processer inom biologin, som inkluderar reglering av proteinuttryck och aktivitet, igenkänning av substrat och kofaktorer av enzymer, samt hur celler uppfattar och vidarebefordrar signaler 1,2. En bättre förståelse av de kinetiska, termodynamiska och strukturella egenskaperna hos protein-ligandkomplexet avslöjar den molekylära grunden för ligandinteraktion och underlättar också rationell läkemedelsdesign genom att optimera läkemedelsinteraktion och specificitet. Ett ekonomiskt och snabbare tillvägagångssätt för att studera protein-ligandinteraktion är att använda molekylär dockning, vilket är en beräkningsmetod som virtuellt screenar ett brett spektrum av små molekyler och förutsäger bindningssättet och affiniteten hos dessa ligander till målproteiner3. Experimentella bevis från högupplösta strukturer bestämda med röntgendiffraktion (XRD), kärnmagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) ger dock det väsentliga beviset för sådana förutsägelser och hjälper till att utveckla nyare och mer effektiva aktivatorer eller hämmare för ett givet mål. I den här artikeln används förkortningen "cryoEM" som tekniken ofta kallas. Det pågår dock en debatt om att välja rätt nomenklatur, och nyligen har termen kryo-genic-sample Electron Microscopy (cryoEM) föreslagits för att indikera att provet har kryogen temperatur och avbildas med elektroner4. På samma sätt har kartorna som härrör från cryoEM kallats elektronpotential, elektrostatisk potential eller Coulombpotential, och för enkelhetens skull använder vi här cryoEM-kartor 5,6,7,8,9,10.

Även om XRD har varit den gyllene standardtekniken inom högupplöst strukturbestämning av protein-ligandkomplex, har kryoEM efter upplösningsrevolutionen11 tagit fart, vilket indikeras av ökningen av Coulomb-potentialkartor eller kryoEM-kartor som deponerats i elektronmikroskopidatabasen (EMDB)12,13 under de senaste åren14. På grund av framsteg inom provberedning, avbildning och databehandlingsmetoder ökade antalet Protein Data Bank (PDB)14-depositioner som använder kryoEM från 0,7 % till 17 % mellan 2010 och 2020, med cirka 50 % av rapporterade strukturer 2020 som bestämdes till 3,5 Å upplösning eller bättre15,16. CryoEM har snabbt antagits av strukturbiologin, inklusive läkemedelsindustrin, eftersom det möjliggör studier av flexibla och icke-kristallina biologiska makromolekyler, särskilt membranproteiner och multiproteinkomplex, med nästan atomär upplösning, vilket övervinner kristallisationsprocessen och erhåller väl diffrakterande kristaller som krävs för högupplöst strukturbestämning med XRD.

Noggrann modellering av liganden i cryoEM-kartan är av största vikt, eftersom den fungerar som en ritning av protein-ligandkomplexet på molekylär nivå. Det finns flera automatiserade ligandbyggande verktyg som används inom röntgenkristallografi som beror på formen och topologin för liganddensiteten för att passa eller bygga in liganden i elektrondensiteten 17,18,19,20. Icke desto mindre, om upplösningen är lägre än 3 Å, tenderar dessa metoder att ge mindre önskvärda resultat eftersom de topologiska egenskaper som de är beroende av för igenkänning och uppbyggnad blir mindre definierade. I många fall har dessa metoder visat sig vara ineffektiva när det gäller att exakt modellera ligander till kryoEM-kartor, eftersom dessa kartor har bestämts i intervallet låg till medelhög upplösning, vanligtvis mellan 3,5 Å-5 Å17.

Det första steget i 3D-strukturbestämning av ett protein-ligandkomplex med cryoEM innebär att antingen samrena liganden med proteinet (när liganden har en hög bindningsaffinitet till proteinet) eller inkubera proteinlösningen med liganden under en viss tid innan rutnätsberedning. Därefter placeras en liten provvolym på ett plasmarengjort håligt TEM-galler, följt av snabbfrysning i flytande etan och slutligen avbildning med en kryo-TEM. 2D-projektionsbilderna från hundratusentals till miljontals enskilda partiklar beräknas som medelvärden för att rekonstruera en 3-dimensionell (3D) Coulomb-potentialkarta över makromolekylen. Att identifiera och modellera ligander och lösningsmedelsmolekyler i dessa kartor innebär betydande utmaningar i många fall på grund av den anisotropa upplösningen över kartan (dvs. upplösningen är inte enhetlig över makromolekylen), flexibiliteten i regionen där liganden är bunden och bruset i data. Många av de modellerings-, förfinings- och visualiseringsverktyg som utvecklades för XRD anpassas nu för användning i cryoEM för samma ändamål 18,19,20,21. I den här artikeln presenteras en översikt över olika metoder och programvara som för närvarande används för att identifiera ligander, bygga modeller och förfina koordinaterna som härrör från cryoEM. Ett steg-för-steg-protokoll har tillhandahållits för att illustrera de processer som är involverade i modellering av ligander med hjälp av specifika protein-ligandkomplex med varierande upplösning och komplexitet.

Det första steget i modellering av ligander i kryoEM-kartor inkluderar identifiering av ligandens densitet (icke-protein) i kartan. Om ligandbindning inte inducerar någon konformationsförändring i proteinet, framhäver beräkningen av en enkel skillnadskarta mellan protein-ligandkomplexet och apo-proteinet i huvudsak regionerna med extra densitet, vilket tyder på närvaron av liganden. Sådana skillnader kan observeras omedelbart, eftersom det bara krävs två kartor, och till och med mellanliggande kartor under processen med 3D-förfining kan användas för att kontrollera om liganden är närvarande. Dessutom, om upplösningen är tillräckligt hög (<3,0 Å), kan differenskartan också ge insikter om platsen för vattenmolekyler samt joner som interagerar med liganden och proteinresterna.

I avsaknad av apo-proteinkartan är det nu möjligt att använda Servalcat22, som är tillgängligt som ett fristående verktyg och som också har integrerats i CCP-EM-mjukvarusviten23,24 som en del av Refmac-förfiningen och i CCP4 8.0 release25,26. Servalcat gör det möjligt att beräkna en FSC-viktad differenskarta (Fo-Fc) med hjälp av de oskarpa halvavbildningarna och apoproteinmodellen som indata. Den utelämnade Fo-Fc-kartan representerar skillnaden mellan den experimentella kartan (Fo) och kartan som härleds från modellen (Fc). I frånvaro av en ligand i modellen tyder en positiv densitet i en Fo-Fc-karta som överlappar med den experimentella EM-kartan vanligtvis på närvaron av liganden. Antagandet här är att proteinkedjan är väl anpassad på kartan, och den återstående positiva densiteten indikerar platsen för liganden. Det är dock viktigt att noggrant undersöka om den positiva densiteten härrör från modelleringsfelaktigheter, till exempel fel rotamer av en proteinsidokedja.

Det andra steget innebär att erhålla eller skapa en kartesisk koordinatfil av liganden med väldefinierad geometri från den tillgängliga kemiska informationen. Standardligander (till exempel ATP och NADP+) som redan finns tillgängliga i CCP4-monomerbiblioteket kan användas för förfining genom att hämta koordinat- och geometrifilerna via deras monomeranslutningskod. För okända eller icke-standardiserade ligander finns dock olika verktyg tillgängliga för att skapa geometrifilerna. Några av exemplen är eLBOW27 - (electronic ligand builder and optimization workbench) i Phenix28, Lidia - ett inbyggt verktyg i Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep 32-a-modulen av Glide inom Schrödinger-sviten. Ligandkoordinatfilen passas sedan in i densiteten, styrd av både den experimentella cryoEM-kartan och differenskartan i Coot. Detta följs av real-space refinement i Phenix28 eller reciprok refining i Refmac33. En Linux-arbetsstation eller en bärbar dator utrustad med ett bra grafikkort och ovan nämnda programvara krävs. De flesta av dessa program ingår i olika sviter. CCP-EM24 och Phenix28 är fritt tillgängliga för akademiska användare och inkluderar en mängd olika verktyg som används i den här artikeln, inklusive Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. På samma sätt ger Chimera37 och ChimeraX38 gratis licenser till akademiska användare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Modellering av fosfoenolpyruvat (PEP) i enolas från Mycobacterium tuberculosis

  1. Identifiering av liganddensitet i kryoEM-kartan för PEP-enolaskomplex
    1. Ladda ner de oskarpa halvkartorna (emd_30988_additional_1.map och emd_30988_additional_2.map) av apo-enolase från ytterligare data i EMDB (se Materialtabell).
    2. Öppna ChimeraX (se Materialförteckning). Öppna halvkartorna av apo-enolase genom att klicka på Öppna i verktygsfältet och välja filnamnen. Skriv vop add #1 #2 i kommandoraden för att kombinera båda halvkartorna för att få den apo-enolase oskarpa kartan.
      OBS: #1 och #2 betecknar de två halva kartorna för enzymet apo-enolas, som nämnts i steg 1.1.1.
    3. Byt namn på den kombinerade kartan (ChimeraX map ID: #3) genom att skriva byt namn #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Färglägg kartan grå från modellpanelen. Kartan visar att enolas är oktameriskt i lösningen med D4-symmetri.
    4. Upprepa steg 1.1.1-1.1.3 med följande halvkartor emd_30989_additional_1.map (kart-ID: 4) och emd_30989_additional_2.map (kart-ID:5) för att få PEP-enolase-unsharpened-map (kart-ID: #6).
    5. För att beräkna en differenskarta, passa först in de två kartorna (PEP-enolas och apo-enolas oskarpa kartor från steg 1.1.3 och steg 1.1.4) på varandra genom att klicka på Fit (karta i karta) i kartpanelen (verktygsfältet) i ChimeraX.
      OBS: Normalisering utförs inte mellan de två kartorna. I vissa fall kan normalisering krävas för att få kartorna till samma skala.
    6. Subtrahera PEP-enolas-kartan från apo-enolas-kartan genom att skriva vop subtrahera #6 #3 på kommandoraden.
      OBS: #6 = PEP-enolas oskarp karta, #3 = Apo-enolas oskarp karta.
    7. Färglägg den subtraherade kartan (kart-ID:7) i grönt, vilket betecknar positiv densitet (enligt konventionen inom röntgenkristallografi)39.
    8. Ladda ner koordinaterna för M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) från Protein Data Bank (PDB), klicka på öppna i verktygsfältet och välj filnamnet.
    9. Byt namn på modellen 7e4x.pdb genom att skriva byt namn #8 Apo_enolase.pdb på kommandoraden. #8 betecknar Apo_enolase.pdb i ChimeraX.
    10. Välj modellen från modellpanelen. Klicka på höger musknapp i verktygsfältet. Klicka på Flytta molekyl för att placera modellen i närheten av PEP-enolaskartan (#6) och justera modellen i förhållande till kartan. Passa in den här modellen i PEP-enolase-unsharpened-map genom att skriva fit #8 i #6 på kommandoraden. Här är kartan numrerad 6 och modellen är numrerad 8.
      OBS: I vissa fall kanske den lokala passningen i ChimeraX inte räcker för att justera modellen. I dessa fall kan ytterligare ett steg av global anpassning (DockinMap, se Materialförteckning) utföras i Phenix.
    11. Spara den monterade modellen genom att skriva spara Apo-enolase.pdb #8 på kommandoraden.
  2. Modellering och förfining av PEP i B-faktorskärpt cryoEM-karta över PEP-enolaskomplex
    1. Öppna "coot" (se Materialtabell) från terminalen genom att skriva ./Coot &.
    2. Visa "Apo-enolase.pdb" genom att klicka på Arkiv > Öppna koordinater Apo-enolase.pdb. Koordinatfilen visas med bindningar (färg per atom).
    3. Ladda ner den PEP-bundna Enolase sharpened map, dvs. emd_30989.map från EMDB. Visa detsamma genom att klicka på Arkiv > Öppna karta > emd_30989.map . Ställ in tröskelvärdet på 7,00 σ genom att rulla med den mellersta musknappen.
    4. Hitta odefinierade blobbar genom att klicka på Verifiera > Omodellerade blobbar > Find Blobs.
    5. Lokalisera den omodellerade liganddensiteten nära resterna på det aktiva stället, Ser 42, Lys-386 och Arg-364 i enolasmodellen.
    6. Hämta PEP-monomermodellfilen från Coot-monomerbiblioteket genom att klicka på Arkiv > Hämta monomer och ange PEP som 3-bokstavskod.
    7. Flytta PEP-molekylen till densiteten med hjälp av alternativet Rotera/Översätt zon/Kedja/Molekyl i sidofältsmenyn. Använd real-space refinement i Coot för att passa in PEP-molekylen i densiteten genom att klicka på Real Space Refine Zone i sidofältets meny. Slå samman den anpassade liganden med Apo-enolase.pdb genom att använda alternativet för att slå samman molekyl på redigeringsfliken . Spara modellen som PEP-Enolase.pdb.
      OBS: Man kan också använda ligand> Jiggle-Fit Ligand-alternativet för att passa liganden också.
    8. För att lägga till ligander till resten av monomererna i koordinatfilen, klicka på Beräkna > NCS-verktyg > NCS-ligander. Ett separat fönster med namnet Find NCS-Related Ligands kommer att visas. För alternativet Protein med NCS, välj koordinatfilen Apo-enolase.pdb och Chain ID A som NCS Master Chain.
      1. För molekylen som innehåller ligand, välj Apo-enolase.pdb som koordinatfil och Chain ID, J och Residue Number 1 till 1. Klicka på Hitta kandidattjänster. Ett fönster med namnet Fitted Ligands kommer att visas med en lista över kandidatpositioner. Utvärdera anpassningen genom att klicka på de enskilda kandidatliganderna och analysera passformen visuellt.
        OBS: I Servalcat/Refmac kan endast en monomermodell tillhandahållas, och symmetrin som används vid rekonstruktion kan ges för att erhålla en utökad modell.
    9. Ytterligare densitet för lösningsmedelsmolekylerna observerades också nära liganden. Högupplösta kristallstrukturer av enolas från olika homologer tyder på närvaron av två Mg2+ joner40,41, vilket troligen stabiliserar den negativa laddningen av reaktionsintermediären. Modellera två Mg2+-joner i den aktiva platsdensiteten genom att klicka på placera atom vid pekaren och välja MG från listan över pekaratomtyper.
      OBS: Bindningens geometri och avstånd kan användas som en guide för att välja metalljon. I fallet med Mg2+ bundet till syreatomer i proteinrester varierar bindningsavståndet mellan 2,1 Å -2,4 Å, med en oktaedrisk geometri. När det gäller lågupplösta kartor är dock samordningssfären ofta ofullständig, och avståndet kan också variera på grund av begränsningar i upplösningen.
    10. Upprepa steg 1.2.8 för att lägga till Mg2+ -jonerna i de symmetrirelaterade monomererna.
    11. Spara modellen genom att klicka på Arkiv > Spara koordinater > Välj Filnamn > och skriv Enolase+PEP+Mg.pdb.
    12. Öppna Phenix grafiska användargränssnitt (se Materialförteckning). Kör ett verkligt utrymmesförfiningjobb med Enolase+PEP+Mg.pdb och emd_30989.map som indatamodell respektive karta med hjälp av standardparametrar. Det här steget görs iterativt med Coot för att uppnå bra mappningsmodellpassning och geometri.
      OBS: Den oskarpa differenskartan används för att visa närvaron av ligand, till exempel i en figur. För modelleringsändamål har kartan med B-faktorskärpa använts och rekommenderas. Den skärpta kartan med B-faktor kan också användas för att beräkna differenskartan i demonstrationssyfte i motsats till den oskarpa kartan. Men om upplösningen är lägre i det område där liganden är bunden, kan det hända att den enda B-faktorn som används för att skärpa hela kartan inte tydligt avslöjar liganddensiteten.
  3. Visualisering och figurgenerering av den modellerade liganden
    1. Öppna den förfinade Enolase+PEP+Mg-modellen från det slutliga Phenix-förfiningsjobbet i PyMOL42 (se Materialförteckning) genom att klicka på Arkiv > Öppna och välja filnamnet.
    2. Ladda emd-30989.map (PEP-bunden skärpt karta) genom att klicka på Arkiv > Öppna och välja filnamnet.
    3. Byt namn på kartan till PEP-sharpened genom att klicka på åtgärder > byta namn mot det emd_30989 objektet och skriva PEP-sharpened.
      OBS: I de flesta fall, till exempel enolas, normaliseras kartorna när de öppnas i pymol eftersom alternativet för att normalisera karta är markerat som standard i pymol. Eftersom cryoEM-kartor är centrerade på en större låda kommer normaliseringen att inkludera allt i rutan. På så sätt kan normaliseringen stängas av innan den öppnas i pymol.
    4. Välj ligander genom att klicka på visa > sekvens.
    5. Skriv isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 på kommandoraden och tryck på enter.
    6. Färga mesh_ligand blå genom att klicka på den sista rutan, C, bredvid det mesh_ligand objektet.
    7. Visa resterna av det aktiva sätet, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 och Lys-386 som interagerar med PEP och Mg2+ i stick- respektive sfärrepresentation, och enolasenzymet i tecknad representation.
    8. Ray trace genom att skriva ray 3600, 3600 för att generera bilder av publikationskvalitet och spara som en png-fil genom att klicka på Arkiv > spara och välja PEP.png som filnamn.

2. Modellering av ligander i metabotrop glutamatreceptor mGlu5

  1. Identifiering och modellering av liganddensiteten i cryoEM-kartan för agonist och antagonistbunden mGlu5
    1. Ladda ner de två halvkartorna tillsammans med deras motsvarande koordinatfiler för vart och ett av de agonistbundna (EMD-31536, 7fd8.pdb) och antagonistbundna (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5-komplexen .
    2. Öppna ChimeraX
      1. Öppna koordinatfilen 7fd8.pdb genom att klicka på öppna och välja 7fd8.pdb.
      2. Skriv delete ligand på kommandoraden och tryck på Retur.
      3. På samma sätt använder du kommandot delete/B för att ta bort kedjan B.
        OBS: Ligander och kedjor kan raderas genom att använda rullgardinsmenyn högst upp med hjälp av välj och åtgärder > atomer/bindningar > ta bort.
      4. Spara den oliganderade pdb:n genom att skriva följande på kommandoraden: spara 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 betecknar modell-ID.
      5. Upprepa stegen 2.1.2.1-2.1.2.4 för 7fd9.pdb.
    3. Öppna CCP-EM. Skapa ett nytt projekt med namnet mGlu5 och ange projektkatalog och användarnamn.
      1. Öppna Relion från alternativen på den vänstra panelen.
        1. Gå till fliken Skapa mask .
        2. Ange en av halvkartorna för EMD-31536 som indata.
          OBS: Relion accepterar kartor med .mrc som suffix, och EMD-kartorna har suffixet .map. Kartfilerna kan öppnas i ChimeraX för undersökning och sparas i .mrc-format.
        3. På fliken mask anger du pixelstorleken som 0,89 Å och tröskelvärdet för initial binarisering som 0,007.
        4. Kör jobbet med aliaset 31536 (eller något annat namn som är lätt att följa).
        5. På samma sätt skapar du en mask för halva kartan EMD – 31537.
      2. Öppna programmet Refmac Servalcat från alternativen i den vänstra panelen i CCPEM.
        1. Ange namnet som mGlu5_agonist.
        2. Importera den 7fd8_noligand_chainA .pdb-filen enligt beskrivningen i modellavsnittet 2.1.2.4. Ange platsen för de två halva kartorna och motsvarande mask som skapats i Relion.
        3. Ange upplösningen som 3,8 Å.
        4. Gå till förfiningsinställningar > Strikt symmetri och nämn C2 som Relion-punktgruppssymmetri.
        5. Starta programmet genom att trycka på startknappen längst upp.
    4. När jobbet är klart öppnar du resultatet i Coot (alternativet finns högst upp i resultatsektionen). Detta kommer att visa en diffmap.mtz i Coot som standard, där färgerna rött och grönt indikerar negativa respektive positiva densiteter.
      1. Gå till Bildskärmshanteraren > egenskaperna för differenskartan märkt DELFWT PHDELWT och ändra konturnivån till 4,0 (absolut värde).
        OBS: Valet av tröskel beror på kartan och upplösningen.
      2. Dölj kartan märkt FWT PHWT och molekylen märkt refined.pdb.
      3. Flytta runt kartan med musen för att visualisera den positiva densiteten (färgad grön) och föra den större klumpen till mitten.
      4. Gå till Arkiv > Hämta monomer, skriv QUS och tryck på enter.
      5. Gå till Calculate > Modeling > Rigid Body Fit-molekylen och dubbelklicka på QUS-monomeren för att justera molekylen så att den passar i Fo-Fc-densiteten.
      6. Använd alternativet merge molecule på redigeringsfliken för att lägga till QUS-molekylen i koordinatfilen, refined.pdb.
      7. Upprepa steg 2.1.4.3-2.1.4.6 för att passa in liganden med monomerkoden NAG och CHS i den mindre klumpen i den extracellulära respektive överst av den transmembrana domänen.
      8. Spara koordinaten som refined_ligands.pdb.
        OBS: Upplösningen för den transmembrana (TM) domänen är lägre, och därför diskuteras den inte här.
  2. Förfining av den liganderade strukturen mGlu5
    1. Öppna CCPEM och klona det tidigare förfiningsjobbet (steg 2.1.3.2) och kör det med refined_ligands.pdb och sharpened map (emd. 31536.mrc) som indata, med standardparametrar och C2-symmetri.
      OBS: Om programmet inte känner igen liganden måste CIF-filerna tillhandahållas. Dessa CIF-filer kan laddas ner från PDB eller genereras med hjälp av olika program (se steg 3.1.1 för detaljer).
  3. Visualisering och figurgenerering i PyMOL
    1. Öppna refined_expanded.pdb-modellen från det senaste Refmac-förfiningsjobbet i PyMOL.
    2. Gå till Arkiv > Öppna och bläddra till Refmac-jobbkatalogen för att läsa in filen diffmap_normalised_fofc.mrc (differenskarta från Servalcat-jobbet i steg 2.1.3.2).
      OBS: Om .mrc-tilläggsfilerna inte är synliga när du bläddrar, ändra filtypen till alla filer och bläddra.
    3. Välj liganderna med hjälp av display > sekvens.
    4. Gå till knappen Åtgärder och byt namn på markeringen till ligander.
    5. Skriv följande på kommandoraden och tryck på enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      OBS: Maskvidden kan justeras. Här används 0,2 maskbredd, och detta ställs in med hjälp av följande kommando: set mesh_width=0.2.
    6. Högerklicka på en av monomererna och gå till kedja > färg för att ange färgen på varje monomer. Färga liganden och nätet med den sista rutan märkt c i liganden och mesh_ligands objekt. mGlu 5-receptordimeren visas i tecknad representation, och monomererna är färgade i kricka och vete. Ligander visas i pinne, och nätet som konturerar liganderna är färgat grönt.
    7. Använd åtgärderna > orientera/centrera/zooma alternativet mot objekten och justera manuellt för att visualisera nätet och tydligt. Välj de närliggande resterna som kan interagera med liganden, till exempel Tyr64, Trp100 för QUS, och visa vid behov deras sidokedja eller huvudkedja eller båda som stickrepresentation.
    8. Ray trace för att generera högupplösta bilder och spara dem som en png-fil.
      OBS: Ovanstående steg upprepas för den antagonistbundna kartan EMD-31537 och motsvarande koordinat file PDB-7fd9.

3. Modellering av hämmaren, deoxigalakto-nojirimycin (DGN), och lösningsmedelsmolekyler i en högupplöst skärpt karta av β-galaktosidas

  1. Identifiering av liganden, DGN, med hjälp av halvavbildningarna från cryoEM
    1. Förberedelse av okänd ligandordbok för modellering [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      OBS: Deoxygalacto-nojirimycin-ordboksfilen ingår i CCP4-monomerbiblioteket som DGJ (3 bokstavs ligand-ID). Icke desto mindre, här betraktas det som en ny och okänd ligand för att illustrera processen att generera ordboksfiler för okända ligander, DGN används som 3-bokstavskoden.
      1. Öppna sammanfattningen av föreningen för deoxygalakto-nojirimycin (DGN) på PubChems webbsida och kopiera leendesträngen för föreningen deoxygalakto-nojirimycin.
      2. Öppna Phenix > Ligander > eLBOW.
      3. Ange smiles-strängen som indata.
      4. Ange lämplig metod för optimering av ligandbyggnad. Här används enkel optimering.
      5. Klistra in den kemiska smiles-strängen i avsnittet för liganddefinition.
      6. Ange en jobbtitel, ett utdatafilsprefix och ligand-ID på lämpligt sätt och tryck på kör.
        OBS: Utdata från jobbet innehåller en koordinatfil, DGN.pdb, och en ordlistefil, DGN.cif-fil. Jligand29 kan också användas för att göra cif-filen.
    2. Ladda ner koordinatfilen för β-galaktosidas (6tsh.pdb) från PDB och ta bort koordinaterna för proteinkedjorna (B, C, D), ligand, DGN och andra lösningsmedelsmolekyler genom att använda en textredigerare eller ta bort kedje-/zonalternativet i Coot. Spara koordinatfilen som apo-betaGal_chainA.pdb.
      OBS: ChimeraX eller Pymol kan också användas för att avlägsna liganden/lösningsmedelsmolekylen.
    3. Ladda ner halvkartorna (emd_10563_half_map_1.map och emd_10563_half_map_2.map) från ytterligare data för EMD-10563-posten från EMDB.
    4. Öppna CCPEM och använd Relion för att skapa masken för kartan vid tröskelvärdet 0,01 (enligt beskrivningen i steg 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. Kör Servalcat (inom CCPEM-sviten som beskrivs i steg 2) med halvavbildningarna som erhölls i steg 3.1.3 och apo-modellen i steg 3.1.2 och D2-symmetri.
      OBS: Modellen måste justeras mot en av halvkartorna eller fullständiga kartorna för att lokalisera liganddensiteten. Detta kan göras genom att passa in modellen i kartan med hjälp av ChimeraX och sedan spara koordinaterna i förhållande till halvkartan. I det här exemplet har halvkartor och den primära kartan i EMDB olika lådstorlekar/rutnät, och modellen måste placeras i halvkartan.
    6. Öppna Coot.
      1. Öppna DGN.cif för ligandordboken som genererades i steg 3.1.1 med Phenix eLBOW. Detta görs genom att gå till Arkiv > Importera CIF-ordlistan och bläddra i eLBOW-jobbkatalogen.
      2. Öppna koordinatfilerna för protein och ligand, apo-betaGal_chainA.pdb från steg 3.1.2 respektive DGN.pdb från steg 3.1.6.
      3. Öppna filen diffmap.mtz automatiskt från Servalcat-jobbet (steg 3.1.5) och visualisera kartan med etiketten DELFWT PHDELWT i Coot. Konturera kartan vid ett tröskelvärde på ~ 4 absolut värde.
        OBS: Det är viktigt att kontrollera kartstatistiken genom att skriva header map.mrc eller använda verktyg i Chimera. All nödvändig information om pixelstorlek, boxstorlek, minsta, medelvärde och maximal densitet och rms-avvikelse från medeldensitet kan erhållas. Det är viktigt att kontrollera pixelstorleken och boxstorleken på cryoEM-kartorna. 3D-kartan representerar protein-ligandkartans volym i ett rutnät med 3D-voxlar. I varje voxel lagras elektronens potentiella värde eller sannolikheten för att hitta elektronen på den platsen. När ett visst tröskelvärde väljs sätts voxlarna, som har en densitet som är lägre än det angivna värdet, till noll. Detta hjälper till att minimera det experimentella bruset i kartan och visualisera kartfunktionerna bättre43. Kartan bör därför kontureras vid en tröskel där kartfunktionerna är lätta att se och bruset i kartan är minimalt.
      4. Gå till Ligand > hitta ligander. I det nya fönstret som visas väljer du ligand, differenskartan och apo-betaGal_chainA.pdb-modellen. Lämna de andra alternativen i standardinställningarna och klicka på Hitta ligander för att starta sökningen.
      5. En lista över de främsta träffarna som visar potentiell liganddensitet visas med en kopia placerad i var och en av densiteterna. Kontrollera manuellt alla träffar där liganden har placerats. Behåll de mest sannolika träffarna och ta bort de tvetydiga.
        OBS: Skillnaden i kartdensitet vid ett högt tröskelvärde tyder tydligt på närvaron av liganden i det aktiva området.
  2. Modellering av ligandens DGN och lösningsmedelsmolekyler
    1. Utför en verklig rymdförfining i Coot för att passa liganden (DGN.pdb) i differensdensitetskartan, och slå sedan samman ligandkoordinaterna med apo-betaGal_chainA.pdb och spara den som betaGal_chainA+ligand.pdb.
      OBS: Liganderna som har placerats i regioner i andra kedjor kan tas bort och slås inte samman när den sammanslagna koordinatfilen sparas. Liganderna i andra kedjor kan genereras av NCS-ligander som visas i exempel 1, steg 1.2.8, eller i Refmac/Servalcat med hjälp av symmetriexpansion.
    2. Kör ett annat Servalcat-jobb som ovan (steg 3.1.5) med betaGal_chainA+ligand.pdb som indatamodell och halvkartorna (från steg 3.1.3) med D2-symmetri.
    3. Differensdensitet (från Servalcat-jobbet i steg 3.2.2) som omger den modellerade liganden tyder på närvaron av lösningsmedelsmolekylerna som samordnar med ligandmolekylen. Den centrala densiteten nära liganden verkar vara för stor för vattenmolekyler.
    4. Baserat på tidigare biokemiska och strukturella data som indikerar närvaron av Mg2+ vid den positionen, modelleras Mg2+-jonen här genom att klicka på alternativet placera atom och ange atomen som MG.
    5. Modellera vattenmolekyler i differensdensiteten i det aktiva sätet som indikerar närvaron av lösningsmedelsmolekyl genom att klicka på placera atomen vid pekaren och välja vatten.
      OBS: Coot har också möjlighet att plocka vattenmolekyler automatiskt. Här, eftersom fokus bara ligger på det aktiva sätet, tillsätts vattenmolekyler manuellt.
    6. Sammanfoga koordinaterna för Mg2+ och vatten med filen betaGal+ligand.pdb och spara den som betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
    7. Med betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb kan du utföra Refmac-förfining i Servalcat med D2-symmetri.
      OBS: Utdatadifferenskartan från det här jobbet kan fungera som ett sätt att validera om liganden har modellerats korrekt, eftersom differenskartan bör visa minimal kvarvarande positiv eller negativ densitet.
  3. Visualisering och figurgenerering med PyMOL
    OBS: Stegen som beskrivs nedan ger några exempel på hur man gör figurer med hjälp av modeller och kartor som kan användas för att illustrera förekomsten av ligander och lösningsmedel.
    1. Öppna refined_expanded.pdb från det senaste Servalcat-jobbet (steg 3.2.6) med liganden och lösningsmedlet modellerade.
    2. Välj olika kedjor separat för att färga dem magenta, gult, grönt och blågrönt, enligt beskrivningen i example 2.
    3. Gå till Visa > sekvens, gör separata val för vattenmolekylerna, magnesium och DGN, och byt namn på objekten till vatten, MG respektive DGN.
    4. Visa MG och vattenmolekyler som sfärer genom att markera objekten, högerklicka och visa > sfär. På samma sätt, visa liganden i stickrepresentation och färglägg liganderna och lösningsmedlen på lämpligt sätt. I det här fallet har liganden färgats gul av en heteroatom, magnesiumjonen är färgad lila och vattenmolekyler är färgade röda.
    5. Välj DGN, MG och vattenmolekyler. Högerklicka och välj åtgärder > kopiera till objekt och namnge det som ligander.
    6. Öppna diffmap_normalised_fo.mrc från Servalcat-jobbet i steg 3.2.6 och byt namn till ligand_fo.mrc. Skriv följande kommando: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      OBS: Ristningsalternativet 2 Å tillämpas runt atomerna, och beroende på upplösningen och kvaliteten på kartorna kan värdena 3-5 användas. Dessutom, när du öppnar cryoEM-kartor i PyMOL, är det lämpligt att stänga av normalize_ccp4_maps.
    7. Använd åtgärderna > orientera/zooma alternativen och justera manuellt för att visualisera liganderna och närliggande interagerande rester (där tillämpligt) som visas i steg 2.3.7.
    8. Ray spåra dessa scener för att spara högupplösta bilder med kommandot ray 3600, 3600.
    9. Spara scenen som .png fil.
      OBS: Följande steg är valfria och beskriver processen för att visualisera (1) differensdensiteten (Fo-Fc) för den omodellerade liganden, DGN, (2) densiteten (Fo) för den modellerade liganden, DGN samt differensdensiteten (Fo-Fc) för omodellerade lösningsmedel och slutligen för (3) densiteten (Fo) för den modellerade liganden, DGN och lösningsmedelsmolekylerna i det aktiva sätet.
    10. För att demonstrera närvaron av liganden, DGN och omgivande lösningsmedelsmolekyler med hjälp av differenskartan, öppna diffmap_normalised_fofc.mrc från Servalcat-jobbet i steg 3.1.5. Byt namn på kartfilen till unliganded_fofc.mrc genom att klicka på åtgärder > byt namn bredvid kartobjektet. Skriv följande på kommandoraden: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligander, nivå=6, carve=2.
    11. För att demonstrera densiteten hos den modellerade liganden, DGN, och den omgivande omodellerade lösningsmedelsdensiteten, öppna diffmap_normalised_fo.mrc samt diffmap_normalised_fofc.mrc från servalcat-jobbet i steg 3.2.2. Byt namn på diffmap_normalised_fo.mrc som DGN_fo och diffmap_normalised_fofc.mrc som DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. Välj MG och vatten från Visa > Sekvens, högerklicka och välj åtgärder > kopiera till objekt och namnge dem som lösningsmedel.
    13. Skriv följande på kommandoraden: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, lösningsmedel, level=6, carve=2.
      OBS: mesh_DGN_fo kommer att visa ligandens densitet, och mesh_solvent_fofc kommer att visa utelämnandedensiteten för MG och vatten.
    14. Slutligen, för att visualisera de modellerade liganderna samt de omgivande lösningsmedelsmolekylerna i det aktiva sätet, öppna diffmap_normalised_fo.mrc från Servalcat-jobbet i steg 3.2.6 och byt namn på det till ligand_fo.mrc.
    15. Skriv följande på kommandoraden: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
      OBS: Här använde vi diffmap_normalised_fo.mrc, men den slutliga skärpta kartan kan användas för att visa densiteten hos ligander och de omgivande resterna. Det är en bra idé att nämna vilken typ av karta som används, B-faktors skärpevärden i figurförklaringen.
    16. Maskbredden och sfärstorleken kan ställas in genom att skriva följande kommandon: set mesh_width=0.2 och set sphere_scale=0.25 för att göra sfärstorleken mindre.
    17. Färga fo mesh blått och fofc mesh grönt.
    18. Använd åtgärderna > orientera/zooma alternativen och justera manuellt för att visualisera liganderna och närliggande interagerande rester (där det är tillämpligt), som visas i steg 2.3.7.
    19. Ray spåra dessa scener för att spara högupplösta bilder med kommandot ray 3600, 3600.
    20. Spara de enskilda scenerna som .png filer.

4. Effekt av upplösning på ligandmodellering i β-galaktosidas

  1. Öppna Terminal och gå till katalogen som innehåller de två halva kartorna.
  2. Öppna de två halva kartorna (steg 3.1.3) i .map-format i ChimeraX, visualisera dem och spara dem som emd10563_half1_1_unfil.mrc och emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. Masken som skapades i steg 3.1.4 kan användas som indata.
  4. Kör ett PostProcessing-jobb i Relion med hjälp av halvmappar och masker från steg 4.2-4.3, med standardparametrarna.
  5. Upprepa steg 4.4, nu med en Skip FSC-vägning aktiverad och specificera ett ad-hoc lågpassfilter på 3 Å.
  6. Upprepa steg 4.4 med ett ad-hoc lågpassfilter på 3.5 Å.
  7. Öppna kartorna (postprocess.mrc) från steg 4.4-4.6, filtrera med olika upplösningar, och modellkoordinaten, 6tsh.pdb (justerad mot halvkartorna i ChimeraX) från steg 3.1.2 i PyMOL. Byt namn på de olika kartorna till 3.0, 3.5 och 2.3 enligt definitionen av deras upplösningar.
    OBS: Man kan bekräfta lågpassfiltreringen av kartorna genom att visualisera dem i ChimeraX eller Coot.
  8. Visualisera effekten av upplösning på densiteten hos ligand- och lösningsmedelsmolekyler genom att skapa ett nät på 2 Å runt liganden och lösningsmedelsmolekylerna vid en tröskel på 6σ som beskrivs i steg 3.3.6 med kartor filtrerade till olika upplösningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Exempel 1
Enzymet enolas från M. tuberculosis katalyserar det näst sista steget i glykolysen och omvandlar 2-fosfoglycerat till fosfoenolpyruvat (PEP), som är en viktig intermediär för flera metaboliska vägar44,45. CryoEM-data för apo-enolas- och PEP-bundna enolasprover samlades in vid samma pixelstorlek på 1,07 Å, och bildbehandling utfördes med Relion 3.146,47. Strukturerna apo-enolas och PEP-enolas bestämdes vid 3,1 Å respektive 3,2 Å,48. Kartorna och modellerna deponerades i EMDB och PDB49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x och PDB-7e51). Enzymets kryoEM-karta visar att det är en oktamer i lösningen (Figur 1A). För att identifiera liganddensiteten i PEP-enolaskartan valdes de oskarpa kartorna av apoenzymet och PEP-bundet enzymet, och en differenskarta beräknades i ChimeraX, genom att subtrahera PEP-enolaskartan från apoenzymkartan. En distinkt densitet (grön) vid en hög tröskel observerades, vilket tydde på närvaron av liganden (Figur 1B). Modellering av proteinkedjan i den oskarpa kartan visade tydligt att den extra densiteten finns i det aktiva sätet av proteinet (Figur 1C). Liganden, PEP, modellerades sedan i B-faktorns skärpta karta med hjälp av Coot, och protein+ligandmodellen förfinades i rymden med Phenix. Två Mg2+ joner modellerades i den densitet som observerades i närheten av liganden (Figur 1D). Liganden, PEP, antar en liknande orientering som observerats i andra enolashomologer, och flera rester av aktiva platser, såsom Lys-386, Arg-364, bildar vätebindningsinteraktioner med liganden PEP. Mg2+-jonerna bildar metallkoordinationsbindningar med Asp-241, Glu-283, Asp-310 och fosfatet av PEP (figur 1D).

Exempel 2
I avsaknad av en tillgänglig apo-proteinstruktur eller om proteinet genomgår en stor konformationsförändring är det inte möjligt att beräkna differenskartorna enligt beskrivningen ovan. År 2021 introducerade Garib Murshudovs grupp vid Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Servalcat22, som implementerar ett arbetsflöde för förfining med hjälp av Refmac och även beräknar en Fo-Fc-differenskarta efter förfining. En positiv Fo-Fc-differenstäthet tyder på närvaron av molekyler/ligander som inte inkluderades i modellen under förfining, i huvudsak en utelämnad karta. Vi rekommenderar dock att du först bedömer modellens passform till kartan i allmänhet och sedan utvärderar differenstäthetskartan.

För att illustrera användningen av Servalcat/Refmac valdes mGlu5, en dimerisk G-proteinkopplad receptor som binder till neurotransmittorn, L-glutamat. Vid bindning av agonisten, L-quisqualate, omorienterar sig den extracellulära domänen, vilket utlöser rotationen av 7TM, vilket för dem närmare för att stabilisera det aktiverade tillståndet. Således observeras en stor konformationsförändring mellan apo/antagonist vs. agonistbundna tillstånd51 (figur 2A och figur 2E). De två halva kartorna för både agonisten (EMD-31536) och antagonisten (EMD-31537) bundna komplexen erhölls från EMDB, och kryoEM-kartorna visar varierad upplösning över molekylen och bättre upplöst extracellulär domän. Därefter användes dessa som indata i Servalcat tillsammans med apo-proteinet som modell för att beräkna differensen eller Fo-Fc-kartan för varje dataset. Denna karta visade tydligt närvaron av olika ligandmolekyler (icke-protein). Upplösningen som uppskattades med FSC (Fourier Shell correlation) för agonist- och antagonistbundna komplex var 3,8 Å respektive 4,0 Å. I fallet med den agonistbundna mGlu5 visade Servalcat Fo-Fc-differenskartan närvaron av både agonisten (L-quisqualate) (Figur 2B) och N-acetylglukosamin (NAG) (Figur 2C) i receptorns ECD (på grund av lägre upplösning av TMD, här fokuserar vi endast på ECD och toppen av TMD). Proteinrester, inklusive Tyr-64, Trp-100, Ser-151 och Thr-175, ses interagera med agonisten. Densitet nära Asn-210-resterna tydde på förekomst av N-acetylglukosamin (Figur 2C). En densitet som överensstämde med kolesterylhemisuccinat, som tillsattes under reningen av mGlu5, observerades nära toppen av transmembranhelix 1 (Figur 2D). Eftersom upplösningen är måttlig och liganden, L-quisqualate, kan placeras i olika riktningar, användes tidigare struktur av den extracellulära domänen med liganden (PDB-6N50) som en guide för att modellera liganden. Antagonistbindningen stabiliserar receptorns öppna eller vilande tillstånd (Figur 2E). En densitet som överensstämde med antagonisten LY341495 observerades vid gångjärnet mellan lob I och lob II i venusflugfällans domän i ECD. Antagonisten interagerar med rester som liknar agonistens. Stapling interaktion mellan Tyr-223 i lob II och antagonisten stabiliserar receptorn i ett öppet tillstånd (Figur 2F). I likhet med agoniststrukturen observerades glykosylering eller förekomst av N-acetylglukosamindel nära Asn-210 (Figur 2G).

Exempel 3
Det tredje exemplet belyser protokollet för att modellera fragmentstora eller små ligander och lösningsmedelsmolekyler i högupplösta CryoEM-kartor. Fragment-based Drug Discovery (FBDD) har vuxit fram som en kraftfull och innovativ metod i utvecklingen av målbaserade nya terapier inom olika sjukdomsområden, vilket gör det till en lovande väg inom läkemedelsforskning och utveckling52,53. FBDD börjar med screening och noggrant urval av små, mycket lösliga, lågmolekylära fragment av molekyler som binder till specifika målproteiner eller biomolekyler av intresse. Bestämning av strukturerna för dessa protein-fragmentkomplex avslöjar bindningssättet för dessa fragment, vilket fungerar som en guide för att designa större och mer komplexa läkemedelsliknande molekyler med ökande affinitet och specificitet mot målproteinet54. Denna metod kräver dock en högupplöst liganddensitet för att exakt bestämma ställningen och korrekt placera de funktionella grupperna i liganden15.

β-galaktosidas, en av de första högupplösta strukturerna som bestämts från framstegen inom kryoEM-tekniken, är ett välstuderat 450 kDa homotetrameriskt enzym som katalyserar hydrolysen av laktos till glukos och galaktos55. För att demonstrera användningen av cryoEM i FBDD bestämde Astex, Storbritannien, strukturen för β-galaktosidas med en hämmare i fragmentstorlek, deoxygalakto-nojirimycin (DGN) bunden i det aktiva stället (EMDB-10563, PDB:6tsh)56. Detta dataset används för att illustrera protokollet för att modellera ligander och lösningsmedel entydigt i högupplösta kartor. För att demonstrera effekten av upplösning på ligandmodellering och visualisering filtrerades kartorna till 3,0 Å och 3,5 Å i efterbehandlingssteget i Relion. Detta belyser kvaliteten på kartans densitet vid olika upplösningar och understryker behovet av högre upplösning för modellering av ligander och lösningsmedel.

Enzymet är en tetramer med D2-symmetri i lösning (figur 3A). Differenskartan (mellan karta och modell), som beräknats av Servalcat, antydde närvaron av DGN och flera lösningsmedelsmolekyler i enzymets aktiva säte (Figur 3B). Vid en uppskattad upplösning på 2,3 Å, uppvisade densiteten högupplösta egenskaper, vilket hjälpte till med den noggranna modelleringen av hämmaren i proteinets aktiva säte. Interaktioner mellan DGN och Tyr-503 och His-540 observerades (Figur 3C). Differensdensiteten antydde också närvaron av lösningsmedelsmolekyler som interagerar med DGN samt proteinresterna. Mg2+ och flera vattenmolekyler modellerades i densiteten (Figur 3D). Metallkoordinationsbindningar mellan Mg2+ och Glu-416, Glu-461 och flera vattenmolekyler observeras (Figur 3D). Mg2+ sågs interagera med DGN via en vattenmolekyl.

Vid en lägre upplösning på 3,5 Å och 3,0 Å liknar liganddensiteten en klump och saknar högupplösta egenskaper som är avgörande för noggrann modellering av liganden (Figur 4A,B). Densiteten för vattenmolekyler var nästan obefintlig vid dessa upplösningar. Sammanfattningsvis, med ökande upplösning, särskilt högre än 3,0 Å, möjliggjorde densiteten modellering av ett större antal vattenmolekyler (Figur 4C,D). Den korrekta positioneringen av ligandens kirala centrum blev möjlig vid ~2,3 Å (Figur 4C,D) på grund av närvaron av distinkta egenskaper i kartan som vägledde placeringen samt modelleringen av vattenmolekyler och Mg2+. Som jämförelse förblev densiteten för Mg2+ urskiljbar över hela upplösningsområdet (figur 4A-C).

Figure 1
Figur 1: Modellering av liganden fosfoenolpyruvat i M. tuberculosis-enolas. (A) visar den skärpta kartan över B-faktorn för det PEP-bundna enolasenzymet. Kartan föreslår att enolas är oktameriskt i lösning, och varje monomer i kartan är färgad på olika sätt. (B) visar en oskarp kryoEM-karta över apo-Enolas-enzymet i grått med differenskartan (mellan PEP-bundna och apo-Enolase oskarpa kartor) överlagrad i grönt, vilket tyder på närvaron av ligand, PEP. Detta är en demonstrationskarta för att visa närvaron av ligander. (C) visar passformen för enolasmodellen i den oskarpa kryoEM-kartan, vilket markerar positionen för differensdensiteten i förhållande till proteinet. Proteinmodellen visas i tecknad representation och färgläggs i Chainbow. Denna figur visar att den extra densiteten (grön) finns i det aktiva sätet för varje monomer. (D) visar liganden, PEP, innesluten i den skärpta kartan med B-faktor, färgad blå. Dessutom observerades densitet för två Mg2+ -joner, vilket bildar metallkoordinationsbindningar med flera rester från det aktiva sätet, inklusive Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 och ligandatomer. Liganden gör vätebindningsinteraktioner med Lys-386, Lys-335 och Arg-364. Proteinresterna visas i stickrepresentation, och Mg2+ -joner visas som lila sfärer. Siffrorna i paneler (A-D) genererades med Pymol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Identifiering, modellering och visualisering av olika ligander i mGlu5-receptorn . Fo-Fc utelämnarkartorna erhölls med hjälp av Servalcat. (A) visar mGlu5 receptor dimer struktur (PDB-7fd8) i tecknad representation, med varje monomer färgad i kricka respektive vete och bunden till agonisten L-quisqualate. Alla ligander som identifierades i den extracellulära och på toppen av receptorns transmembrandomän är inneslutna i Fo-Fc-uteslutningskartan, färgade gröna och konturerade vid 6σ. (B) markerar passformen av agonisten, L-quisqualat innesluten i differenskartan. L-quisqualate interagerar med flera mGlu5-rester inklusive Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 och Gly-280. H-bindningsinteraktionerna representeras av röda streck. I (C) är en ytterligare densitet uppenbar nära Asn-210, som finns i receptorns extracellulära domän, och N-acetylglukosaminmolekyl (NAG) modellerades i denna densitet. För tydlighetens skull är NAG inte kopplad till Asn i den aktuella figuren. (D) visar skillnaden i densitet för kolesterolhemisuccinat (CHS) i grönt nära den lipidexponerade ytan av receptorn. CHS-molekylen, representerad i pinnarna, modellerades i denna densitet. (E) visar mGlu5-receptorstrukturen (PDB-7fd9) bunden till antagonisten LY341495 i tecknad representation. I (F) indikerar en extra densitet i Fo-Fc-differenskartan som ligger vid gångjärnet mellan lob I och lob II i den extracellulära domänen närvaron av antagonisten. Nyckelrester (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 och Tyr-223) runt antagonisten visas i stickrepresentationer, och potentiella vätebindningsinteraktioner med antagonisten visas i röda streck. (G) visar skillnaden i densitet som tyder på närvaron av NAG-molekyl nära Asn-210 i den antagonistbundna strukturen (observera att NAG inte är kopplad till Asn för tydlighetens skull). Siffrorna genererades med Pymol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Identifiering, modellering och förfining av en liten hämmare och lösningsmedelsmolekyler i den högupplösta kartan över β-galaktosidas (EMD-10563). (A) visar β-galaktosidasmodellen upplöst till 2,3 Å (PDB: 6tsh) i tecknad representation, där varje monomer är tydligt färgad. Den grå rutan markerar ligandbindningsstället. (B) visar Fo-Fc-differensdensiteten (från Servalcat) i grönt nät i enzymets aktiva säte. Skillnaden i densitet tyder på närvaron av hämmaren (DGN) och flera lösningsmedelsmolekyler i det aktiva sätet. (C) visar att med hjälp av Fo-Fc-kartan modelleras hämmaren deoxygalakto-nojirimycin (DGN) i det aktiva sätet. Denna modellerade ligand avbildas i stickformat och innesluten i Fo-densiteten (av Servalcat), som är färgad i blue_mesh. Vätebindningsinteraktioner mellan DGN och flera proteinrester, inklusive Tyr-503 och His-540, observeras. Den extra Fo-Fc-differenstätheten runt liganden (grön) är en indikation på lösningsmedelsmolekylerna. (D) Kartan visar att flera lösningsmedelsmolekyler, inklusive vatten och Mg2+, representerade som röda respektive lila sfärer, modelleras i det aktiva sätet efter att ha säkerställt att varje lösningsmedelsmolekyl är bunden till antingen protein (Glu-416, His-418 och Glu-461) eller ligandrester. Vattenmolekylerna och Mg2+ är inneslutna i Fo-densiteten (blått nät). Mg2+ ses interagera med liganden, DGN via en vattenmolekyl. Fo-Fc-kartan (grönt nät) i paneler (B,C) är konturerad vid 6σ, medan Fo-densiteten - blått nät i C och D (från Servalcat-förfiningen efter modellering) är konturerad vid 3σ. Siffrorna i paneler (A-D) genererades med Pymol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Effekt av upplösning på ligandmodellering i β-galaktosidas. Halvkartor från EMD-10563 användes som indata i Relions efterbehandlingsteg, och de kombinerade efterbehandlingskartorna filtrerades till upplösningarna 2,3 Å, 3,0 Å, och 3,5 Å med olika B-faktorer. Kartan som visas i alla paneler är konturerad vid 6σ. För tydlighetens skull visas endast proteinets ryggrad utan sidokedjor, ligand eller lösningsmedelsmolekyler i panelerna A, B och C. (A) Kartan filtreras till 3,5 Å, och det aktiva sätet för β-galaktosidas visas. En klump som liknar liganden, DGN, ses i den här upplösningen, tillsammans med några mindre blobbar i närheten. Att modellera liganden i rätt riktning visar sig vara utmanande på grund av bristen på distinkta funktioner på kartan. (B) Kartan filtrerad till 3.0 Å upplösning visas. Här blir ligandklumpen något mer definierad men saknar fortfarande funktioner i allmänhet. Några fler små klumpar som tyder på lösningsmedelsmolekyler observeras också. (C) Kartan filtrerad till 2,3 Å upplösning avslöjar liganddensiteten med distinkta egenskaper, särskilt avslöjar stolkonformationen av iminosockret. Ett betydande antal små klumpar som motsvarar vattenmolekyler observeras vid denna upplösning. Den automatiska B-faktorskattningen/skärpan i Relion efterbehandling ger ett värde på -18 Å2 för kartorna filtrerade till 3 Å och 3,5 Å, medan värdet är -52 Å2 för kartan filtrerad till 2,3 Å. Olika B-faktorskärpor av EM-kartor kan också utföras med Coot och är användbara vid modellbygge. (D) Panelen illustrerar att liganden DGN (stickrepresentation), Mg2+, och vattenmolekyler (som sfärer) som modelleras i det aktiva sätet och den skärpta kartan vid 2,3 Å, visas i blått nät som omger dessa atomer. Siffrorna i paneler (A-D) genererades med Pymol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förbättringarna i hårdvara och mjukvara för mikroskop har resulterat i en ökning av antalet kryoEM-strukturer under de senaste åren. Även om den högsta upplösningen som för närvarande uppnås i kryoEM med en partikel är 1,2 Å 57,58,59, bestäms majoriteten av strukturerna runt 3-4 Å upplösning. Modellering av ligander i kartor med medelhög till låg upplösning kan vara knepigt och ofta fyllt av tvetydighet. Med tanke på den utbredda användningen av kryoEM inom både den akademiska världen och läkemedelsindustrin för translationell forskning och läkemedelsupptäckt är det viktigt att se till att ligander modelleras korrekt och utan tvetydighet. Därför är det klokt att kvantifiera upplösningsbarheten av ligandatomer genom att beräkna Q-poäng60, som nu finns tillgängliga i EMDB som ett mått för att utvärdera kvaliteten på kartorna och modellens passform samt i Chimera.

I det första exemplet användes ChimeraX för att beräkna differenskartan i det verkliga rummet mellan apo och de ligandbundna kartorna i enzymet M. tuberculosis. Den extra densiteten vid en hög tröskel tyder på närvaron av liganden, fosfoenolpyruvat, i det aktiva stället och Mg2+ bundet till liganden. Det är viktigt att notera att kartan i detta fall är av medelhög upplösning (3,2 Å), och vattenmolekyler kan inte modelleras med säkerhet (Figur 1). Begränsningen med denna metod är att den endast kan tillämpas när ligandbindning inte inducerar signifikanta konformationsförändringar i proteinet. Kartnormalisering utfördes inte i det här fallet eftersom både de apo- och ligandbundna datauppsättningarna förvärvades med samma pixelstorlek och bearbetades med identiska parametrar i Relion. Det är dock värt att notera att när man jämför kartor som genererats av olika rekonstruktionsprogram, såsom Relion46,47 och CryoSparc61, eller med olika kvalitet, blir normalisering av kartorna avgörande innan meningsfulla jämförelser kan göras.

Nästa exempel är mGlu5, som genomgår en stor molekylär omorganisation vid agonistbindning, vilket framgår av kryoEM-strukturerna51,62 (figur 2). I detta scenario är det inte möjligt att beräkna en enkel differenskarta mellan de obundna (apo) och ligandbundna receptorerna på grund av betydande skillnader mellan kartorna. Här användes Servalcat, som använder oskarpa och oviktade halvavbildningar som indata för förfining i det reciproka rummet och därefter beräknar en differenskarta mellan den experimentella kartan och den karta som härleds från modellen. Vid en hög tröskel kan man visualisera skillnader och fungera som en guide för korrigering och förbättring av modellen. Flera omodellerade blobbar i den extracellulära och nära transmembrandomänen av mGlu5 observerades och användes som en guide för att modellera ligander (Figur 2).

Det tredje exemplet visar hur upplösning (2,3 Å) spelar en avgörande roll vid tolkning och modellering av en fragmentstor hämmare i β-galaktosidas. Här var utmaningen att identifiera en mycket liten ligand (<200 Da) i Servalcat differenskartan mitt i det inneboende bruset i data och modellera den exakt. Förutom den höga globala upplösningen som bestämdes med hjälp av Fourier Shell Correlation (FSC), var den lokala upplösningen som var specifik för liganden också tillräckligt hög för att säkerställa korrekt placering av ligandernas kirala centra (Figur 3). Densitet för lösningsmedelsmolekyler observerades i differenskartan genom hela enzymet och särskilt kring liganden. Effekten av upplösning på modelleringsligander och lösningsmedelsatomer visades också (Figur 4). Det är viktigt att vara försiktig vid modellering av vatten- eller lösningsmedelsmolekyler eftersom brus vid låg tröskel ibland kan likna vatten- eller lösningsmedelsmolekyler, vilket leder till potentiella feltolkningar.

En annan viktig faktor är att kryoEM-kartorna ensamma kanske inte är tillräckliga för att exakt identifiera en metalljon på egen hand. Ytterligare biofysikaliska metoder som Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) eller Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX) är ofta nödvändiga för att bekräfta närvaron och identiteten av metalljonen. I både enolas- och β-galaktosidasenzymer modellerades Mg2+ på grund av den stora mängd information som redan finns tillgänglig om dessa proteiner, vilket bekräftar metalljonens identitet. Koordinationen av metalljonerna i dessa fall, exemplifierad av den klassiska oktaedriska geometrin och de nästan ideala koordinationsavstånden för Mg2+, gav också betydande bevis på deras identitet.

I allmänhet bör några viktiga överväganden beaktas vid modellering av ligander i kryoEM-kartor. Till att börja med är det viktigt att välja rätt karta för identifiering och modellering av ligander. I samtliga fall rekommenderas en oskarp och oviktad karta eller halvkarta över en skärpt och viktad karta för att visualisera ligandens densitet, eftersom skärpa och viktning kan resultera i under- eller överskärpta (brus på grund av serieavslutning) regioner på kartan. Detta kan resultera i en suboptimal liganddensitet, och användningen av olika B-faktorskärpor kan användas för att utvärdera densiteten under modellbygge i Coot. Även om det finns en risk med att använda den skärpta kartan för att identifiera ligander i en cryoEM-karta, kanske den oskarpa kartan inte visar hela detaljen i liganddensiteten men kan användas för demonstrationsändamål, som visas i figur 1B,C.

Ställningen för den modellerade liganden bör valideras, särskilt i fall där data är svaga. Som visas här för mGlu5 varierar den lokala upplösningen över kryoEM-kartan, och opartisk modellering av liganden kan vara utmanande. Servalcat kan användas som ett värdefullt verktyg för att upptäcka potentiella felaktigheter i protein- och ligandmodellering22.

Sammansättningsheterogenitet kan finnas i ett protein-ligandkomplex där endast en specifik population kan ha liganden närvarande (om liganden har låg molekylvikt kanske klassificeringssteget inte tar bort heterogeniteten). Det är dock viktigt att utföra 3D-klassificeringssteget iterativt under bildbehandlingen före ligandmodellering och verifiera om ligandens densitet förbättras. Om det finns flera kopior av protein bör man vara försiktig när man tillämpar symmetri över kartan under initial modellgenerering och förfining, eftersom detta kan jämna ut liganddensiteten i alla symmetrirelaterade molekyler. Symmetri bör endast införas efter att kartan har inspekterats noggrant för att bekräfta förekomsten av liganddensitet i alla proteinkedjor.

Beroende på tillståndet (kristall eller lösning) och platsen (begravd eller yta) kan atomerna vara dynamiska, och vid modellförfining kallas detta för atomförskjutningsparametern (ADP). Tillsammans med differenskartan, som ger visuella ledtrådar till eventuella felaktigheter i modellen, kan ADP-värden användas för att utvärdera ligandernas noggrannhet efter förfining 64,65,66,67. Vanligtvis bör liganden ha liknande ADP-värden som de omgivande resterna, dvs. om de är stabilt bundna och modellerade korrekt. Ligander i periferin eller atomerna i en ligand (som lipider) som är långt från makromolekyler kan dock ha högre ADP-värden. Förutom att förfina koordinaterna tillåter både Refmac33,34 och Phenix förfining av ADP-värdena28,68. I Refmac används Mott-Bethe-approximationen för att beräkna elektronspridningsfaktorn för enskilda atomer under kartberäkning. I den senaste versionen av Phenix har individuell B-faktorförfining, liknande kristallografi, introducerats för att förklara atomstörning. Mycket ofta, i de förfinade modeller som härrör från cryoEM, observeras ett brett spektrum av ADP-värden (ibland värden nära noll), och även den Q-poäng som används i EMDB för att utvärdera modellens passform med kartan beror på den primära kartan som deponeras och karaktären av B-faktorskärpa60. Vid kryoEM-modellbygge används ofta flera kartor, och därför bör de kartor som används vid modellering och förfining tydligt nämnas i metoderna, eftersom på grund av anisotrop upplösning i många makromolekyler kanske en enda karta inte räcker för att förklara alla detaljer. 

Vid modellering av ligander i makromolekyler är en av de största begränsningarna med kryoEM-kartor (som i kristallografi) att om ligandbindningsstället är av låg upplösning eller om den bundna liganden är dynamisk, kan det vara svårt att fastställa den korrekta konformationen. Dessutom har de flesta kryoEM-strukturer upplösningar under 3 Å, och representationen av vattenmolekyler i kartorna är begränsad, vilket gör det svårt att bedöma rollen av hydrering i ligand eller läkemedelsbindning (som visas här med exemplen enolas och mGluR). Beräkningsmetoder kan användas i kombination med kryoEM-data för att ta itu med dessa begränsningar69. Till skillnad från kristallografi är det bara modellen som genomgår förfining, inte kartan. För närvarande är den enda metoden för att indikera närvaron av en ligand eller säkerställa korrekt modellering att generera utelämna kartor (med hjälp av verktyg som Servalcat). Det finns alltså ett antal verktyg för att hjälpa forskare att bygga och utvärdera modellen, men det finns flera områden inom modellförfining där nyare tillvägagångssätt eller modifieringar av nuvarande tillvägagångssätt kan förväntas inom en snar framtid.

I den här artikeln har vi fokuserat på de nuvarande metoderna för modellering av ligander, som inkluderar manuell inspektion av liganddensiteten, generering av ligandgeometrifilen, följt av modellering av liganden i cryoEM-kartan. Detta är en spännande period inom strukturbiologi och läkemedelsutveckling, eftersom direkta elektrondetektorer med snabbare bildhastigheter och användning av snabbare datainsamling70 har resulterat i erhållandet av högupplösta kartor (<2,8 Å) av flera makromolekyler som ofta är bundna till småmolekylära ligander på relativt kort tid. Den senaste introduktionen av automatiserade ligandmodelleringsverktyg som GEMspot69 i Schrödinger-sviten och EMERALD17 i Rosetta-sviten, som försöker hitta den mest sannolika bundna ställningen för liganden samtidigt som man tar hänsyn till experimentella cryoEM-data, lovar att effektivisera och automatisera denna process. I likhet med röntgenkristallografi föreställer man sig att det kommer att bli en realistisk möjlighet att identifiera bindningssätten för småmolekylära ligander med hjälp av kryoEM, kanske två eller fler på en enda dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

SJ är mottagare av doktorandtjänsten från DAE-TIFR, och finansieringen är erkänd. KRV erkänner DBT B-Life-anslaget DBT/PR12422/MED/31/287/2014 och stödet från Department of Atomic Energy, Indiens regering, under projektidentifikationsnummer. RTI4006.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCP4-8.0 Consortium of several institutes https://www.ccp4.ac.uk Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM Consortium of several institutes https://www.ccpem.ac.uk/download.php Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot  Paul Emsley, LMB, Cambridge https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix) Consortium of several institutes https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank  Consortium of several institutes https://www.ebi.ac.uk/emdb/ Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon Thermo Fisher Scientific  https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf Commercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix  Consortium of several institutes https://phenix-online.org/download Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank Consortium of several institutes https://rcsb.org Public database of macromolecular structures
Pymol Schrodinger https://pymol.org/2/ Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion MRC-LMB, Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios Thermo Fisher Scientific  https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		 Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ General purpose software for display, analysis and more

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 209
Modellering av ligander till kartor härledda från elektronkryomikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K.… More

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter