Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry & Microbiology, University of Venda

Summary

פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.

Abstract

חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא חלבון שמור המאפשר קיפול של חלבונים אחרים בתוך התא, מה שהופך אותו למלווה מולקולרי. בעוד Hsp70 אינו חיוני עבור תאי E. coli הגדלים בתנאים רגילים, מלווה זה הופך להיות חיוני לצמיחה בטמפרטורות גבוהות. מאחר ש-Hsp70 שמור מאוד, אחת הדרכים לחקור את תפקוד המלווה של גנים מסוג Hsp70 ממינים שונים היא לבטא אותם באופן הטרולוגי בזני E. coli שחסרים ב-Hsp70 או לבטא Hsp70 מקורי שנפגע מבחינה תפקודית. תאי E. coli dnaK756 אינם מסוגלים לתמוך בדנ"א של λ בקטריופאג'. יתר על כן, Hsp70 (DnaK) המקומי שלהם מציג פעילות ATPase מוגברת תוך הפגנת זיקה מופחתת ל- GrpE (גורם חילופי נוקלאוטידים Hsp70). כתוצאה מכך, תאי E. coli dnaK756 גדלים כראוי בטמפרטורות הנעות בין 30 °C (75 °F) ל 37 °C (75 °F), אך הם מתים בטמפרטורות גבוהות (>40 °C). מסיבה זו, תאים אלה משמשים מודל לחקר פעילות המלווה של Hsp70. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליישום תאים אלה לביצוע בדיקת השלמה, המאפשרת לחקור את פונקציית מלווה הצלולו של Hsp70.

Introduction

חלבוני הלם חום ממלאים תפקיד חשוב כמלווים מולקולריים בכך שהם מסייעים לקיפול חלבונים, מונעים צבירת חלבונים והופכים קיפול שגוישל חלבונים 1,2. חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא אחד המלווים המולקולריים הבולטים ביותר, הממלא תפקיד מרכזי בהומאוסטזיס של חלבון 3,4. DnaK הוא E. coli Hsp70 homologue5.

בדיקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבוססות תאים שונות פותחו כדי לחקור את פעילות המלווה של Hsp70 ולסנן מעכבים המכוונים למלווה זה 6,7,8. Hsp70 הוא חלבון שמור מאוד. מסיבה זו, מספר Hsp70s של אורגניזמים אאוקריוטים, כגון פלסמודיום falciparum (הסוכן העיקרי של מלריה), דווחו כתחליף לתפקוד DnaK ב- E. coli 6,9. בדרך זו, פותחה בדיקת השלמה מבוססת E. coli הכוללת את הביטוי ההטרולוגי של Hsp70s ב- E. coli כדי לחקור את הפונקציה cytoprotective שלהם. בדרך כלל, בדיקה זו כוללת ניצול של תאי E. coli אשר חסרים עבור DnaK או המבטאים DnaK מקורי כי הוא בסכנה תפקודית. בעוד DnaK אינו חיוני לצמיחת E. coli בתנאים רגילים, הוא הופך להיות חיוני כאשר התאים גדלים בתנאים מלחיצים כגון טמפרטורות גבוהות או צורות אחרות של מתח10,11.

זני E. coli שפותחו כדי לחקור את תפקוד Hsp70 באמצעות בדיקת השלמה כוללים E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) ו- E. coli dnaK756. תאי E. coli dnaK103 מייצרים DnaK קטוע שאינו מתפקד, וככזה, התאים גדלים כראוי ב 30 ° C, בעוד הזן רגיש לקור ומתח חום12,13. באופן דומה, זן E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) אינו גדל מעל 40°C14,15. זן E. coli dnaK756 מבטא DnaK טבעי מוטנטי (DnaK756) המאופיין בשלושה תחליפי גליצין לאספרטט במיקומים 32, 455 ו-468, מה שגורם לתוצאות פרוטאוסטטיות בסיכון. כתוצאה מכך, זן זה עמיד בפני בקטריופאג' λ DNA14. בנוסף, E. coli dnaK756 מציג פעילות ATPase מוגברת, בעוד זיקתו לגורם חילופי הנוקלאוטידים, GrpE, מופחתת16. אי קולי זנים מוטנטיים של DnaK משמשים כמודלים אידיאליים לחקר פעילות המלווה של Hsp70 באמצעות גישת השלמה. מאחר ש-DnaK חיוני רק בתנאי לחץ, בדיקת ההשלמה מתבצעת בדרך כלל בטמפרטורות גבוהות (איור 1). כמה יתרונות של שימוש E. coli עבור מחקר זה כוללים גנום מאופיין היטב, צמיחה מהירה, ואת העלות הנמוכה של גידול ותחזוקה17.

במאמר זה, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול הכולל שימוש בתאי E. coli dnaK756 כדי לחקור את הפונקציה של Hsp70. ה-Hsp70s בהם השתמשנו בבדיקה הם מסוג פרא DnaK והנגזרת הכימרית שלו, KPf (המורכבת מתחום ATPase של DnaK המאוחה לתחום קשירת המצע C-terminal של Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F התבטא באופן הטרולוגי כבקרה שלילית, שכן המוטציה למעשה חוסמת אותו ממצע קשירה, ובכך מבטלת את פעילות המלווה שלו9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טרנספורמציה

הערה: השתמש בכלי זכוכית סטריליים לתרבית, קצוות פיפטה ומדיה טרייה ואוטומטית. הכינו תרביות של תאי E. coli ב-2x שמרים טריפטון (YT) [1.6% טריפטון (w/v), 1% תמצית שמרים (w/v), 0.5% NaCl (w/v), 1.5% אגר (w/v)] אגר. ריאגנטים כלליים המשמשים בפרוטוקול ומקורותיהם מובאים בטבלת החומרים.

  1. תווית 2.0 מ"ל צינורות microcentrifuge ו aliquot 50 μL של תאי E. coli dnaK756מוכשר, שמירה על התאים על קרח.
  2. לצינורות מיקרוצנטריפוגות 2.0 מ"ל עם תאים מתאימים, aliquot 10-50 ng של pQE60/DnaK, pQE60/KPf ו- pQE60/KPf-V436F פלסמיד DNA9 לצינורות נפרדים.
  3. שמור את צינורות מיקרוצנטריפוגות 2.0 מ"ל המכילים את התאים המוסמכים ואת DNA פלסמיד על קרח במשך 30 דקות.
  4. מחממים את תערובת התאים-דנ"א המוסמכת למשך 60 שניות ב-42 מעלות צלזיוס ומחזירים את צינורות המיקרוצנטריפוגות בחזרה על קרח למשך 10 דקות.
  5. הוסיפו 950 מיקרוליטר של ציר YT טרי 2x (מודגר מראש ב-37°C) ודגרו ב-37°C תוך כדי ניעור ב-150°/min למשך שעה. השאירו את התאים לגדול במשך זמן רב יותר כדי לעודד את התאוששותם במידת הצורך.
    הערה: הימנע מטלטול נמרץ של התאים.
  6. פיפטה 100 μL של התאים ולהפיץ אותם על 2x לוחות אגר YT המכילים 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין עבור הזן המתאים, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין (ראה טבלה של חומרים) עבור בחירת פלסמיד.
  7. צנטריפוגה את שאר התאים (שנפחם כיום הוא כ 900 μL) במשך דקה אחת ב 5000 x גרם (ב 4 ° C) באמצעות מיקרוצנטריפוגה benchtop.
  8. דקנט על 800 μL של המרק ולהשתמש בתווך הנותר כדי להשעות מחדש את התאים כדוריים.
  9. צלחת את התאים התאושש על צלחת אגר YT 2x.
  10. לדגור על שתי צלחות אגר לילה (או כ 17 שעות) ב 37 ° C.
    הערה: תאים אלה גדלים לאט מאוד וייתכן שיהיה צורך לדגור עליהם למשך זמן רב יותר. היזהר לזהות את המושבות אשר עשוי להתחיל קטן מאוד. הלוח המכיל תאים התלויים מחדש לאחר צנטריפוגה (שלב 1.7) משמש כגיבוי למקרה שיעילות הטרנספורמציה של התאים ירודה, ובמקרה זה התאים הכדוריים עשויים לשפר את ההתאוששות של תאים מותמרים. עם זאת, אם יעילות הטרנספורמציה מצוינת, לוחית האגר שעליה צופו תאים מרוכזים עשויה להתאפיין בתרבית מגודלת בעת הדגירה, מה שמקשה על זיהוי מושבות בודדות. במקרה כזה, צלחת האגר השנייה עשויה להיות זו שעליה צומחות מושבות מרווחות היטב.

2. ציפוי תאים

  1. הרימו מושבה אחת מהטרנספורמנטים וחסנו אותה ל-10 מ"ל של מרק YT 2x בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין לבחירת תאי E. coli dnaK756, ו-100 מק"ג/מ"ל אמפיצילין לבחירת פלסמיד.
    הערה: השתמש בצלוחיות (≥50 מ"ל) כדי להבטיח אוורור בעת התסיסה של התרבית. יש לדגור על החיסון למשך הלילה (17 שעות) בטמפרטורה של 37°C תוך כדי ניעור ב-150 סיבובים לדקה.
  2. קח קריאת ספיגה ב OD600 למחרת בבוקר.
  3. נקו את משטח שולחן העבודה באמצעות אתנול 75% כדי לספוג את המשטח כהכנה לאיתור תאים.
  4. באמצעות צינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, תקנן את התרבית לקריאת OD600 של 2.0 באמצעות מרק YT 2x.
    הערה: ודא שקריאות OD נלקחות כראוי מכיוון ששלב זה חשוב לסטנדרטיזציה של צפיפות התאים בין הדגימות השונות.
  5. באמצעות 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, להכין דילולים סדרתיים של התאים מ 100 ל 10-5.
  6. יש לדגור על צלחות האגר שישמשו לאיתור התאים בתנור בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לצלחות להתייבש עם מכסים פתוחים חלקית כדי להבטיח שאדי המים יבריחו.
    הערה: כדי להבטיח שהתאים מזוהים במרחקים מופרדים באופן אחיד, צייר קווים על פיסת נייר שעליה מודפסת תבנית של אתרי תצפית.
  7. נקודה 2 μL של התאים המדוללים סדרתית על לוחות אגר בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין, 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין, 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין, ו 0.5 mM IPTG (להשראת ביטוי של חלבונים רקומביננטיים) (ראה טבלת חומרים).
  8. אתר כל דגימה על שני לוחות נפרדים (אחד יודגר ב 37 ° C והשני ב 43.5 ° C).
    הערה: הימנעו מפירסינג בצלחת האגר.
  9. דגימות בקרה נקודתיות על אותה צלחת כמו דגימות הניסוי כדי למזער את ההשפעות הסביבתיות.
  10. בצע את האיתור במהירות כדי להבטיח שהתהליך יושלם לפני שהתאים יתחילו לגדול, מכיוון שהדבר עלול ליצור דפוסי צמיחה מוטים.
    הערה: חשוב להימנע מאירוסולים בעת תצפית, מכיוון שאלה יזהמו את הלוחות. חשוב גם לשמור על הצלחות סגורות בין הכתמים כדי למנוע זיהום.
  11. לדגור צלחת אחת ב 37 ° C (טמפרטורת גידול מתירני) ואת השני בטמפרטורת צמיחה מתירנית של 43.5 ° C.
    הערה: יש לדגור על הצלחות הפונות כלפי מטה כדי למנוע הצטברות אדים על המכסה, מכיוון שהמים המרוכזים ישטפו את המושבות המנומרות ממקומן.
  12. מניחים את כל הצלחות באינקובטורים בו זמנית ונמנעים מפתיחת האינקובטור עד למחרת בבוקר.
    הערה: פתיחת דלת האינקובטור מספר פעמים במהלך הדגירה של הלוחות אינה מומלצת. הסיבה לכך היא שהגישה של אוויר לתוך האינקובטור עלולה לגרום לתנודות טמפרטורה המשפיעות לרעה על צמיחת התאים.

3. אישור ביטוי של חלבונים רקומביננטיים

  1. באמצעות לולאה סטרילית, לאסוף חלק מהתאים הנותרים מאותה מושבה של תאי E. coli dnaK756 מותמרים.
  2. יש לחסן את התאים במרק YT של 10 מ"ל בתוספת קנמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל, טטרציקלין של 10 מיקרוגרם/מ"ל ואמפיצילין של 100 מק"ג/מ"ל. יש לדגור למשך הלילה (17 שעות) ב-37°C צלזיוס תוך כדי טלטול ב-150 סיבובים לדקה.
  3. להעביר את התרבית לתוך 90 מ"ל של מרק סטרילי 2x YT המכיל את האנטיביוטיקה הדרושה כאמור בשלב 3.2. תן לתאים לגדול לשלב אמצע יומן (OD600 = 0.4-0.6).
  4. קח 2 מ"ל של תרבית המדגם לפני האינדוקציה (דגימת אינדוקציה של 0 שעות).
  5. הוסף IPTG לריכוז סופי של 1 mM כדי לגרום לייצור חלבונים ולדגור מחדש את התאים ב 37 ° C.
  6. קח דגימה שנייה של 2 מ"ל 6 שעות לאחר הזירוז.
  7. קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 5000 x גרם במשך 10 דקות. שמור על טמפרטורת הצנטריפוגה על 4 °C (75 °F).
  8. השליכו את הסופרנטנט.
  9. יש להשהות מחדש את הגלולה במאגר PBS (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.

4. ניתוחי SDS-PAGE ו-Western Blot

  1. הכינו 2x 10% ג'ל SDS כמתואר קודם19.
  2. שמור את אחד מג'לי SDS-PAGE לצביעה עוקבת באמצעות כתם קומאסי כדי להציג את רצועות החלבון. השתמש בג'ל SDS-PAGE השני כדי לבצע ניתוח כתמים מערביים.
  3. Aliquot 80 μL של דגימות resuspended ולערבב אותו עם 20 μL של 4x Laemmli SDS טוען חיץ.
  4. מרתיחים את המתלה ב-100°C למשך 10 דקות. לאחר מכן טען 10 μL מכל דגימה על ג'ל SDS precast (ראה טבלת חומרים).
  5. בצע אלקטרופורזה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת באמצעות מתח של 120 V בתמיסה אחת של מאגר הפעלה SDS (25 מ"מ Tris, 250 mm glycine, 0.1% (w/v) SDS).
  6. צבעו את הג'ל בכתם קומאסי (ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת, ולאחר מכן החזיקו באמצעות חיץ מעכב (50% מתנול, 10% (v/v) חומצה אצטית במים מזוקקים) למשך שעתיים.
  7. דמיינו את רצועות החלבונים הקיימות בג'ל באמצעות מערכת הדמיה של ג'ל (ראו טבלת חומרים). הפעל מחדש ג'ל SDS-PAGE אחר עם אותן דגימות בהתאם לפרוטוקול הנ"ל.
  8. כאשר הריצה האלקטרופורטית מסתיימת, יש ליטול ג'לים מסוג SDS-PAGE כדי לבצע ניתוח כתמים מערביים כפי שתואר קודם לכן19.
  9. שטפו את קרום הניטרוצלולוז שאליו הועברו החלבונים שלוש פעמים בחיץ שטיפה (TBS-Tween, pH 7.4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
  10. השתמש ב- α-DnaK (ראה טבלת חומרים) כדי לזהות את DnaK ואת α-PfHsp70-17 כדי לזהות KPf ואת המוטציה שלו, KPf-V436F), בהתאמה.
  11. יש להשתמש בנוגדנים בדילול 1:2000 בחלב 5% ללא שומן. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C תוך כדי טלטול ב-60 סיבובים/דקה למשך שעה אחת.
  12. יש להסיר נוגדנים שאינם קשורים באופן ספציפי על ידי שטיפת קרום הניטרוצלולוז ב-TBS-Tween 3 פעמים תוך 15 דקות.
  13. לדגור על הממברנה בנוגדן המשני (α-ארנב, ראה טבלת חומרים) באותם תנאים כמו השלב הקודם. זה ואחריו כביסה לאחר מכן באותם תנאים כמו הנוגדן העיקרי.
  14. פתור את הפסים באמצעות מגיב זיהוי כימילומינסנציה משופרת (ECL).
  15. דמיינו את הפסים באמצעות מצלמת ג'ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מציג תמונה של האגר הסרוק המכיל תאים שנצפו וגודלו בתרבית בטמפרטורת גידול מתירנית של 37°C ו-43.5°C, בהתאמה. בצד ימין של איור 2, רכיבי הכתם המערבי שנכרתו מייצגים את הביטוי של DnaK, KPf ו-KPf-V436F בתאי E. coli dnaK756. כצפוי, כל תאי E. coli dnaK756 בתרבית בטמפרטורת גידול מתירנית של 37 מעלות צלזיוס הצליחו לגדול. אולם בתנאי גידול לא מתירניים של 43.5 מעלות צלזיוס, רק תאים המבטאים באופן הטרולוגי DnaK ו-KPf הצליחו לגדול, כפי שדווח קודם לכן 6,9,20 (איור 2). מצד שני, תאים המבטאים KPf-V436F גדלו רק ב 37 ° C אבל לא הצליחו לגדול ב 43.5 ° C. זה מדגים כי DnaK ו- KPf הצליחו לשחזר את פגם הגדילה של תאי E. coli dnaK756 בתנאי עקת חום. הכישלון של תאים המבטאים באופן הטרולוגי KPf-V436F לתמוך בצמיחת תאים בטמפרטורה של 43.5 מעלות צלזיוס מדגים את חוסר תפקוד המלווה של חלבון זה. בהקשר זה, KPf-V436F משמש חלבון שליטה שלילי אידיאלי.

Figure 1
איור 1: עקרון בדיקת ההשלמה באמצעות תאי E. coli dnaK756 כדי לחקור את תפקוד המלווה של חלבונים בעלי ביטוי הטרולוגי. E. coli dnaK756 מבטא חלבון DnaK756 מקומי שאינו מסוגל להגן על התאים מפני עקת חום. החדרת Hsp70 הטרולוגי פונקציונלי מציל את התאים ממוות בחשיפה לעקת חום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בדיקת לוחות השלמה המדגימה את היכולות של DnaK ו-KPf להגן על תאי E. coli dnaK756 מפני עקת חום. התאים שעברו טרנספורמציה גודלו בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (טמפרטורת גידול מתירנית) ו-43.5 מעלות צלזיוס (טמפרטורת גדילה לא מתירנית). התאים עברו סטנדרטיזציה וצופו כדילולים סדרתיים. 'N' מסמל 'מסודר', המייצג את המקום הראשון המורכב מתאים לא מדוללים. בצד ימין קיצוני נמצאות כריתות הכתם המערבי המייצגות ביטוי של שלושת החלבונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול מדגים את התועלת של תאי E. coli dnaK756בחקר תפקוד המלווה של Hsp70 מבוטא באופן הטרולוגי. בדיקה זו יכולה להיות מאומצת כדי לסנן מעכבים המכוונים לתפקוד Hsp70 בצלולו. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי Hsp70s שאינם מסוגלים להחליף DnaK ב E. coli אינם תואמים לבדיקה זו. חוסר שינוי לאחר תרגום21 של כמה Hsp70s שאינם ילידי עשוי להסביר את חוסר התפקוד שלהם בתוך מערכת E. coli . בדיקת השלמה מבוססת שמרים22 עשויה לענות על חלק מהחסרונות של הבדיקה מבוססת E. coli.

מספר שלבים מרכזיים חיוניים להבטחת תוצאות הניתנות לשחזור. אלה כוללים הבטחה כי רק תאים שהשתנו על ידי מבנה פלסמיד בהתאמה משמשים במהלך הציפוי. בנוסף, חשוב למנוע זיהום של התרבות לאורך כל השלבים. יתר על כן, מכיוון שתאי E . coli DnaK לחוצים רגישים לנימה מוגזמת10, חשוב להימנע מרעד נמרץ במהלך התרבית, שכן זן פיזי זה מקדם נימה נרחבת. תאים מנוממים יתר על המידה נותנים קריאות גדילה כוזבות גבוהות יותר ב- OD600, מה שמוביל להערכת יתר של צמיחת התרבית ומשפיע לרעה על סטנדרטיזציה של תאים לפני הציפוי. למרות Hsp70 אינו חיוני לצמיחה E. coli בתנאים רגילים, תאים חסרים חלבון זה רגישים ללחץ10. מסיבה זו, תאי E. coli dnaK756 גדלים הרבה יותר לאט לאחר טרנספורמציה או במהלך ההתאוששות שלהם ממלאי גליצרול. בנוסף, הם רגישים מאוד לתנודות טמפרטורה. לכן, חשוב להימנע מפתיחת דלת האינקובטור ברגע שמניחים את צלחות האגר המצופות בפנים עד שהגיע הזמן לראות את הצלחות.

נתוני הכתם המערבי חשובים כדי לאשר את הביטוי של חלבוני Hsp70 רקומביננטיים בהתאמה בתאי E. coli dnaK756. כישלון לבטא את החלבון המתאים מוביל לתוצאה שלילית שגויה עבור תאים הגדלים תחת טמפרטורת גידול לא מתירנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgments

העבודה נתמכה באמצעות מענק שהתקבל מהמרכז הבינלאומי להנדסה גנטית וביוטכנולוגיה (ICGEB), HDI/CRP/012, מנהל המחקר של אוניברסיטת ונדה, מענק I595, המחלקה למדע וחדשנות (DSI) וקרן המחקר הלאומית (NRF) של דרום אפריקה (מספרי מענקים, 75464 ו-92598) שהוענקו ל-AS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 8,05,740 Constituent for sample loading dye
Acetic acid Labchem 101005125 Constituent of destainer
Acrylamide Sigma-Aldrich 8008300100 Component of SDS
Agar Merck HG000BX1.500 Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose Clever Scientific 14131031 Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 101875295 Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin VWR International 0339—EU—25G Selective antibiotic
Bis Sigma-aldrich 1015460100 Component of SDS
Bromophenol Sigma-Aldrich 0449-25G Constituent for sample loading dye
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue VWR International 443293X SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate Sigma-Aldrich RB10368 Constituent of PBS buffer
ECL Thermofischer Scientific 32109 Western blot detection reagent
Ethidium Bromide Thermofischer Scientific 17898 DNA intercalating dye
Glycerol Merck SAAR2676520L Constituent for sample loading dye
Glycine VWR International 10119CU Component of SDS
IPTG Glentham life sciences 162IL inducer
Kanamycin Melford K0126 Selective antibiotic
Magnesium Chloride Merck SAAR4123000EM Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol Labchem 113140129 Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate Merck 1,04,87,30,250 Constituent of PBS buffer
Peptone Merck HG000BX4.250 Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride Merck SAAR5042020EM Constituent of PBS buffer
PVDF membrane Thermofischer scientific PB7320 Western blot membrane
Sodium Chloride Merck SAAR5822320EM Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate VWR International 108073 To resolve expressed proteins
Spectramax iD3 Separations 373705019 Automated plate reader
TEMED VWR international ACRO420580500 Component of SDS gel
Tetracycline Duchefa Biochemies T0150.0025 Selective antibiotic
Tris VWR International 19A094101 Component of SDS gel
Tween20 Merck SAAR3164500XF Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber Thermofisher Scientific PB0112 Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract Merck HG000BX6.500 Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody Inqaba BK CAC09317 Primary antibody
α-rabbit antibody Thermofischer scientific 31460 Secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
  2. Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
  3. Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
  4. Edkins, A. L., Boshoff, A. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).
  5. Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
  6. Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
  7. Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
  8. Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
  9. Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
  10. Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
  11. Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
  12. Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
  13. Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
  14. Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
  15. Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
  16. Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
  17. Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
  18. Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
  19. Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007).
  20. Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
  21. Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
  22. Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 205
<i>Escherichia coli </i>-מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rachel Ncube, H., Dali, U., Harmfree … More

Rachel Ncube, H., Dali, U., Harmfree Dongola, T., Shonhai, A. Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70. J. Vis. Exp. (205), e66515, doi:10.3791/66515 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter