Summary
Denne protokollen demonstrerer chaperoneaktiviteten til varmesjokkprotein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-celler tjener som en modell for analysen da de har en innfødt, funksjonshemmet Hsp70, noe som gjør dem utsatt for varmestress. Den heterologe introduksjonen av funksjonell Hsp70 redder vekstmangelen til cellene.
Abstract
Varmesjokkprotein 70 (Hsp70) er et konservert protein som letter foldingen av andre proteiner i cellen, noe som gjør det til en molekylær chaperone. Mens Hsp70 ikke er avgjørende for E. coli-celler som vokser under normale forhold, blir denne chaperone uunnværlig for vekst ved forhøyede temperaturer. Siden Hsp70 er svært konservert, er en måte å studere chaperone-funksjonen til Hsp70-gener fra forskjellige arter å heterologisk uttrykke dem i E. coli-stammer som enten er mangelfulle i Hsp70 eller uttrykker en innfødt Hsp70 som er funksjonelt kompromittert. E. coli dnaK756 celler er ikke i stand til å støtte λ bakteriofag DNA. Videre viser deres opprinnelige Hsp70 (DnaK) forhøyet ATPase-aktivitet mens de demonstrerer redusert affinitet for GrpE (Hsp70 nukleotidutvekslingsfaktor). Som et resultat vokser E. coli dnaK756-celler tilstrekkelig ved temperaturer fra 30 ° C til 37 ° C, men de dør ved forhøyede temperaturer (>40 ° C). Av denne grunn tjener disse cellene som en modell for å studere chaperonaktiviteten til Hsp70. Her beskriver vi en detaljert protokoll for anvendelse av disse cellene for å utføre en komplementeringsanalyse, noe som muliggjør studiet av cellulo-chaperonfunksjonen til Hsp70.
Introduction
Varmesjokkproteiner spiller en viktig rolle som molekylære chaperoner ved å lette proteinfolding, forhindre proteinaggregering og reversere proteinfolding 1,2. Varmesjokkprotein 70 (Hsp70) er en av de mest fremtredende molekylære chaperonene, og spiller en sentral rolle i proteinhomeostase 3,4. DnaK er E. coli Hsp70 homolog5.
Ulike biofysiske, biokjemiske og cellebaserte analyser er utviklet for å utforske chaperonaktiviteten til Hsp70 og for å skjerme for hemmere rettet mot denne chaperone 6,7,8. Hsp70 er et svært konservert protein. Av denne grunn har flere Hsp70-er av eukaryote organismer, som Plasmodium falciparum (hovedmidlet til malaria), blitt rapportert å erstatte DnaK-funksjonen i E. coli 6,9. På denne måten har en E. coli-basert komplementeringsanalyse blitt utviklet som involverer det heterologe uttrykket av Hsp70s i E. coli for å utforske deres cytoprotektive funksjon. Vanligvis innebærer denne analysen bruk av E. coli-celler som enten er mangelfull for DnaK eller som uttrykker en innfødt DnaK som er funksjonelt kompromittert. Mens DnaK ikke er avgjørende for E. coli-vekst under normale forhold, blir det viktig når cellene dyrkes under stressende forhold som forhøyede temperaturer eller andre former for stress10,11.
E. coli-stammer som er utviklet for å studere Hsp70-funksjonen ved hjelp av en komplementeringsanalyse, inkluderer E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 (Am) thr:: Tn10]) og E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-celler produserer en avkortet DnaK som ikke er funksjonell, og som sådan vokser cellene tilstrekkelig ved 30 °C, mens belastningen er følsom for kulde og varmespenning 12,13. På samme måte vokser ikke E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1)-stammen over 40 °C14,15. E. coli dnaK756-stammen uttrykker en mutant innfødt DnaK (DnaK756) karakterisert ved tre glycin-til-aspartat-substitusjoner i posisjonene 32, 455 og 468, noe som gir opphav til kompromitterte proteostatiske utfall. Følgelig er denne stammen resistent mot bakteriofag λ DNA14. I tillegg viser E. coli dnaK756 forhøyet ATPase-aktivitet, mens affiniteten til nukleotidutvekslingsfaktoren, GrpE, reduseres16. E. coli DnaK-mutantstammer fungerer som ideelle modeller for å undersøke chaperonaktiviteten til Hsp70 gjennom en komplementeringstilnærming. Siden DnaK bare er essensielt under stressende forhold, utføres komplementeringsanalysen vanligvis ved forhøyede temperaturer (figur 1). Noen fordeler med å bruke E. coli for denne studien inkluderer det velkarakteriserte genomet, rask vekst og de lave kostnadene ved dyrking og vedlikehold17.
I denne artikkelen beskriver vi i detalj en protokoll som involverer bruk av E. coli dnaK756-celler for å studere funksjonen til Hsp70. Hsp70-ene vi benyttet i analysen er villtype DnaK og dets kimære derivat, KPf (består av ATPase-domenet til DnaK smeltet sammen med det C-terminale substratbindende domenet til Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F ble heterologisk uttrykt som en negativ kontroll siden mutasjonen i hovedsak blokkerer den fra bindende substrater, og dermed opphever sin chaperoneaktivitet9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transformasjon
MERK: Bruk sterilt glass til kultur, pipettespisser og nytilberedte og autoklaverte medier. Forbered kulturer av E. coli-cellene i 2x gjærtrypton (YT) [1,6% trypton (w / v), 1% gjærekstrakt (w / v), 0,5% NaCl (w / v), 1,5% agar (w / v)] agar. Generelle reagenser som brukes i protokollen og deres kilder er gitt i materialfortegnelsen.
- Merk 2,0 ml mikrosentrifugerør og alikot 50 μL kompetente E. coli dnaK756-celler, og hold cellene på is.
- Til 2,0 ml mikrosentrifugerør med kompetente celler, alikot 10-50 ng pQE60/DnaK, pQE60/KPf og pQE60/KPf-V436F plasmid DNA9 i separate rør.
- Hold 2,0 ml mikrosentrifugerørene som inneholder kompetente celler og plasmid-DNA på is i 30 minutter.
- Varmesjokk de kompetente cellene-DNA-blandingen i 60 s ved 42 °C og returner mikrosentrifugerørene tilbake på is i 10 minutter.
- Tilsett 950 μL fersk 2x YT buljong (pre-inkubert ved 37 ° C) og inkuber ved 37 ° C mens du rister ved 150 omdreininger / min i 1 time. La cellene vokse mye lenger for å oppmuntre til utvinning om nødvendig.
MERK: Unngå å riste cellene kraftig. - Pipett 100 μL av cellene og spre dem på 2x YT-agarplater inneholdende 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin for den respektive stammen og 100 μg/ml ampicillin (se materialfortegnelse) for plasmidvalg.
- Sentrifuger resten av cellene (hvis volum nå er ca. 900 μL) i 1 min ved 5000 x g (ved 4 °C) ved hjelp av en stasjonær mikrosentrifuge.
- Dekanter ca. 800 μl av buljongen og bruk det gjenværende mediet til å resuspendere de pelleterte cellene.
- Plate de gjenopprettede cellene på 2x YT agarplaten.
- Inkuber begge agarplatene over natten (eller ca. 17 timer) ved 37 °C.
MERK: Disse cellene vokser veldig sakte og må kanskje inkuberes mye lenger. Vær forsiktig med å få øye på koloniene som kan starte veldig små. Platen som inneholder celler resuspendert etter sentrifugering (trinn 1.7) fungerer som en sikkerhetskopi i tilfelle transformasjonseffektiviteten til cellene er dårlig, i hvilket tilfelle de pelleterte cellene kan forbedre utvinningen av eventuelle transformerte celler. Imidlertid, hvis transformasjonseffektiviteten er utmerket, kan agarplaten som konsentrerte celler ble belagt på, være preget av en overgrodd kultur ved inkubasjon, noe som gjør det vanskelig å identifisere enkeltkolonier. I så fall kan den andre agarplaten være den som godt fordelte kolonier vokser på.
2. Cell plating
- Plukk opp en enkelt koloni fra transformantene og inokuler den i 10 ml 2x YT-buljong supplert med 50 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml tetracyklin for valg av E. coli dnaK756-cellene og 100 μg / ml ampicillin for plasmidvalg.
MERK: Bruk kolber (≥50 ml) for å sikre lufting ved omrøring av kulturen. Inkuber inokulumet over natten (17 timer) ved 37 °C mens du rister ved 150 rotasjoner/min. - Ta en absorbansavlesning på OD600 neste morgen.
- Rengjør arbeidsbenkoverflaten med 75% etanol for å vattpinne overflaten som forberedelse til cellespotting.
- Bruk et 2 ml mikrosentrifugerør, standardiser kulturen til en OD600-avlesning på 2,0 ved bruk av 2x YT-buljong.
MERK: Forsikre deg om at OD-avlesningene tas riktig, da dette trinnet er viktig for å standardisere celletetthet på tvers av de forskjellige prøvene. - Bruk 2 ml mikrosentrifugerør, fremstill serielle fortynninger av cellene fra 100 til 10-5.
- Inkuber agarplatene som skal brukes til å oppdage cellene i en ovn satt ved 40 ° C for å la platene tørke med lokkene delvis åpne for å sikre at vanndamp slipper ut.
MERK: For å sikre at cellene blir oppdaget på jevnt adskilte avstander, tegner du linjer på et stykke papir som en mal for spottingsteder skrives ut på. - Spot 2 μL av de serielt fortynnede cellene på agarplatene supplert med 50 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml tetracyklin, 100 μg / ml ampicillin og 0,5 mM IPTG (for induksjon av ekspresjon av de rekombinante proteiner) (se materialtabellen).
- Spot hver prøve på to separate plater (en som skal inkuberes ved 37 °C og den andre ved 43,5 °C).
MERK: Unngå å stikke hull på agarplaten. - Spotkontrollprøver på samme plate som eksperimentelle prøver for å minimere miljøeffekter.
- Utfør spotting raskt for å sikre at prosessen er fullført før cellene begynner å vokse, da dette kan generere skjeve vekstmønstre.
MERK: Det er viktig å unngå aerosoler når du ser det, da disse kan forurense platene. Det er også viktig å holde platene lukket mellom flekkene for å unngå forurensning. - Inkuber den ene platen ved 37 °C (tillatt veksttemperatur) og den andre ved den ikke-tillatte veksttemperaturen på 43,5 °C.
MERK: Inkuber platene som vender opp ned for å unngå at damp samler seg på lokket, da kondensvannet ville vaske de flekkete koloniene av deres posisjoner. - Plasser alle platene i inkubatorene samtidig og unngå å åpne inkubatoren til neste morgen.
MERK: Åpning av inkubatordøren flere ganger under inkubering av platene frarådes. Dette skyldes at tilgangen til luft inn i inkubatoren kan føre til temperatursvingninger som påvirker celleveksten negativt.
3. Bekrefte ekspresjon av rekombinante proteiner
- Ved hjelp av en steril sløyfe, plukk opp en del av de gjenværende cellene fra samme koloni av transformerte E. coli dnaK756-celler.
- Inokuler cellene i 10 ml YT buljong supplert med 50 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml tetracyklin og 100 μg / ml ampicillin. Inkuber over natten (17 timer) ved 37 °C mens du rister ved 150 omdreininger/min.
- Overfør kulturen til 90 ml steril 2x YT-buljong som inneholder nødvendig antibiotika som nevnt i trinn 3.2. La cellene vokse til midten av loggfasen (OD600 = 0,4-0,6).
- Ta 2 ml av kulturprøven før induksjon (0 timers induksjonsprøve).
- Legg IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM for å indusere proteinproduksjon og re-inkubere cellene ved 37 ° C.
- Ta en ny prøve på 2 ml 6 timer etter induksjon.
- Høst cellene ved å sentrifugere ved 5000 x g i 10 minutter. Hold sentrifugetemperaturen på 4 °C.
- Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i PBS-buffer (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) og oppbevar ved -20 °C.
4. SDS-PAGE og western blot analyser
- Forbered 2x 10% SDS geler som tidligere beskrevet19.
- Oppbevar en av SDS-PAGE-gelene for etterfølgende farging ved hjelp av Coomassie-flekker for å se proteinbåndene. Bruk den andre SDS-PAGE-gelen til å utføre western blot-analyse.
- Aliquot 80 μL av de resuspenderte prøvene og bland den med 20 μL 4x Laemmli SDS lastebuffer.
- Kok suspensjonen ved 100 °C i 10 minutter. Legg deretter 10 μL av hver prøve på den prefabrikkerte SDS-gelen (se materialfortegnelse).
- Utfør elektroforese ved romtemperatur i 1 time ved bruk av en spenning på 120 V i en 1x løsning av SDS-løpebuffer (25 mm Tris, 250 mm glycin, 0,1% (w / v) SDS).
- Beis gelen med Coomassie-flekk (se materialfortegnelse) i 1 time, etterfulgt av avfarging med avfaringsbuffer (50% (v/v) metanol, 10% (v/v) eddiksyre i destillert vann) i 2 timer.
- Visualiser proteinbåndene som er tilstede i gelen ved hjelp av et gelavbildningssystem (se materialfortegnelse). Kjør en annen SDS-PAGE gel med de samme prøvene etter ovennevnte protokoll.
- Når den elektroforetiske kjøringen avsluttes, ta SDS-PAGE-geler for å utføre western blot-analyse som tidligere beskrevet19.
- Vask nitrocellulosemembranen som proteinene ble overført til tre ganger i vaskebuffer (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
- Bruk α-DnaK (se materialfortegnelse) til å oppdage henholdsvis DnaK og α-PfHsp70-17 for å oppdage KPf og dets mutant, KPf-V436F.
- Bruk antistoffene ved en 1:2000 fortynning i 5% fettfri melk. Inkuber ved 4 °C mens du rister ved 60 omdreininger/min i 1 time.
- Fjern ikke-spesifikt bundet antistoff ved å vaske nitrocellulosemembranen i TBS-Tween 3 ganger på 15 minutter.
- Inkuber membranen i det sekundære antistoffet (α-kanin, se materialfortegnelse) under samme forhold som forrige trinn. Dette etterfølges av etterfølgende vask under samme forhold som det primære antistoffet.
- Løs båndene ved hjelp av forbedret kjemiluminescens (ECL) deteksjonsreagens.
- Visualiser båndene ved hjelp av en gel-imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser et bilde av den skannede agar med celler som ble oppdaget og dyrket ved den tillatte veksttemperaturen på henholdsvis 37 °C og 43,5 °C. På høyre side av figur 2 representerer utskårne vestlige blotkomponenter uttrykket av DnaK, KPf og KPf-V436F i E. coli dnaK756-celler. Som forventet klarte alle E. coli dnaK756-cellene dyrket ved den tillatte veksttemperaturen på 37 °C å vokse. Under de ikke-tillatte vekstbetingelsene på 43,5 °C klarte imidlertid bare celler som heterologisk uttrykker DnaK og KPf å vokse, som tidligere rapportert 6,9,20 (figur 2). På den annen side vokste celler som uttrykker KPf-V436F bare ved 37 °C, men klarte ikke å vokse ved 43,5 °C. Dette viser at DnaK og KPf var i stand til å gjenopprette vekstdefekten til E. coli dnaK756-celler under varmespenningsforhold. Svikt i celler som heterologt uttrykker KPf-V436F for å støtte veksten av celler ved 43,5 ° C, demonstrerer mangelen på chaperone-funksjon av dette proteinet. I denne forbindelse tjener KPf-V436F som et ideelt negativt kontrollprotein.
Figur 1: Prinsipp for komplementeringsanalysen ved bruk av E. coli dnaK756-celler for å studere chaperone-funksjonen til heterologisk uttrykte proteiner. E. coli dnaK756 uttrykker et naturlig DnaK756-protein som ikke er i stand til å beskytte cellene mot varmestress. Innføring av funksjonell heterolog Hsp70 redder cellene fra død ved eksponering for varmestress. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Komplementeringsplateanalyse som demonstrerer egenskapene til DnaK og KPf for å beskytte E. coli dnaK756-celler mot varmestress. De transformerte cellene ble dyrket ved 37 °C (permissiv veksttemperatur) og 43,5 °C (ikke-permissiv veksttemperatur). Cellene ble standardisert og belagt som seriefortynninger. 'N' symboliserer 'Neat', som representerer det første stedet som består av ufortynnede celler. Ytterst til høyre er de vestlige flekkeksisjonene som representerer ekspresjon av de tre proteinene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen demonstrerer nytten av E. coli dnaK756-celleri å utforske chaperone-funksjonen til heterologisk uttrykt Hsp70. Denne analysen kan brukes til screenhemmere rettet mot Hsp70-funksjonen i cellulo. Imidlertid er en begrensning av denne metoden at Hsp70s ikke kan erstatte DnaK i E. coli ikke er kompatible med denne analysen. Mangel på posttranslasjonell modifikasjon21 av noen ikke-innfødte Hsp70s kan forklare deres mangel på funksjon innenfor E. coli-systemet . En gjærbasert komplementeringsanalyse22 kan adressere noen av manglene i den E. coli-baserte analysen.
Flere viktige trinn er avgjørende for å sikre reproduserbare resultater. Disse inkluderer å sikre at bare celler transformert av den respektive plasmidkonstruksjonen brukes under plettering. I tillegg er det viktig å unngå forurensning av kulturen gjennom trinnene. Videre, siden stressede E. coli DnaK-celler er utsatt for overdreven filamentering10, er det viktig å unngå kraftig risting under kultur, da denne fysiske belastningen fremmer omfattende filamentering. Overdreven filamenterte celler gir høyere falske tilsynelatende vekstavlesninger ved OD600, noe som fører til overestimering av kulturvekst og negativt påvirker cellestandardisering før plating. Selv om Hsp70 ikke er avgjørende for E. coli-vekst under normale forhold, er celler som mangler dette proteinet stressfølsomme10. Av denne grunn vokser E. coli dnaK756-celler mye langsommere etter å ha blitt transformert eller under utvinning fra glyserollagre. I tillegg er de ekstremt følsomme for temperatursvingninger. Derfor er det viktig å unngå å åpne inkubatordøren når de belagte agarplatene er plassert inne til det er på tide å se platene.
Western blot-dataene er viktige for å bekrefte ekspresjonen av de respektive rekombinante Hsp70-proteinene i E. coli dnaK756-celler. Unnlatelse av å uttrykke det respektive proteinet fører til et falskt negativt resultat for celler som vokser under ikke-permissiv veksttemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet med tilskuddsmidler hentet fra International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) grant number, HDI/CRP/012, Research Directorate ved University of Venda, grant I595, Department of Science and Innovation (DSI) og National Research Foundation (NRF) i Sør-Afrika (grant numbers, 75464 &; 92598) tildelt AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I.
- Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007).
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
