Summary
一种很少使用的电生理记录方法，即基础记录，可以分析传统记录方法无法检查的味觉编码特征。基础记录还可以分析对疏水刺激的味觉反应，这是使用传统电生理学方法无法研究的。
Abstract
昆虫通过味觉毛发或感器来品尝外部世界，这些毛发或感器在其尖端有毛孔。当感器与潜在的食物来源接触时，食物来源的化合物会通过毛孔进入并激活其中的神经元。50 多年来，这些反应一直使用一种称为尖端记录的技术进行记录。然而，这种方法有很大的局限性，包括无法测量刺激接触之前或之后的神经活动，以及要求品尝剂可溶于水溶液。我们在这里描述了一种我们称之为基础录音的技术，它克服了这些限制。基础记录允许在刺激之前、期间和之后测量味觉神经元的活动。因此，它允许对味觉刺激后发生的OFF反应进行广泛分析。它可用于研究疏水性化合物，例如在水中溶解度非常低的长链信息素。总之，基础记录作为测量神经元活动的手段，具有单感子电生理学的优点 - 高空间和时间分辨率，无需遗传工具 - 并克服了传统尖端记录技术的关键限制。
Introduction
昆虫，包括果蝇，被赋予了复杂的味觉系统，使它们能够从周围环境中提取复杂的化学信息。该系统使他们能够辨别各种物质的化学成分，区分有营养的物质和有害的物质 1,2。
该系统的核心是被称为味觉毛发或感器的特殊结构，它们战略性地位于身体的各个部位。在果蝇中，这些感器位于标签上，标签是苍蝇头部的主要味觉器官1,2,3,4，以及腿和翅膀1,2,5,6。标签位于长鼻的尖端，包含两个裂片 4,7,8。每个叶上覆盖着 31 种味觉，分为短、长、中4、7、8。这些感觉器每个容纳 2-4 个味觉神经元 1,2,9,10。这些味觉神经元表达至少四个不同基因家族的成员，即味觉受体 （Gr）、离子受体 （Ir）、扒手 （Ppk） 和瞬时受体电位 （Trp） 基因 1,2,11,12,13.这种受体和通道的多样性使昆虫能够识别多种化合物，包括非挥发性和挥发性线索1,2,14。
50 多年来，科学家们使用一种称为尖端记录的技术量化了味觉神经元及其受体的反应：3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ，25,26,27,28，
29,30,31,32,33,34,35。然而，这种方法有很大的局限性。首先，神经活动只能在与刺激物接触期间测量，而不能在接触之前或之后测量。此限制排除了对自发尖峰活动的测量，并阻止了对 OFF 响应的测量。其次，只有可溶于水溶液的品尝剂才能进行测试。
这些限制可以通过一种很少使用的替代电生理技术来克服，该技术称为“碱基记录”。在这里，我们描述了这种技术，我们采用了 Marion-Poll 及其同事24 使用的方法，并展示了它现在可以方便地测量的关键味觉编码特征14。
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Protocol
以下协议符合耶鲁大学的所有动物护理指南。
1. 苍蝇
- 将10-15只新出现的苍蝇在25°C和60%相对湿度的新鲜标准培养瓶中，在12：12小时的光暗循环中。
- 在3-7天大时使用苍蝇。
2. 化学感觉刺激
- 获得最高可用纯度的化学感觉刺激。按照供应商的建议存放它们直到使用。
- 溶解化学感觉刺激，并在水或其他所需的无毒溶剂（如石蜡油）中稀释至所需浓度。在溶解的固体化合物的情况下，将制备的溶液搅拌至少1小时。
3.玻璃刺激毛细管
- 使用移液器拉动器仪器拉动玻璃毛细管以保持来自硼硅酸盐玻璃毛细管（100 mm长，1 mm外径，0.58 mm内径）的刺激。目标是实现 3 μm 至 10 μm 之间的尖端直径。
- 使用微量加载器移液器吸头用首选的刺激溶液填充玻璃毛细管。注意避免产生气泡，可以通过轻轻敲击来去除气泡。
- 如果刺激物在尖端结晶，请清洁或更换玻璃刺激毛细管。
4. 参比电极和记录电极
- 使用钨棒（直径 127 μm，长度 76.2 mm）用于参比电极和记录电极。将参比电极和记录电极的尖端锐化至直径约1μm（这些电极的形状在Delventhal等人中描绘。36） 将它们反复浸入 10% KNO3 （~1 M） 溶液或 10% KOH （1.8 M） 溶液中几秒钟。
注意：此解决方案需要电流 （0.3-3 mA） 才能促进此过程。
5. 准备苍蝇进行基地记录
- 从小瓶中抽出一只苍蝇进入吸液器。取出吸气器，将手指放在吸气器末端以诱捕动物。
- 将苍蝇排出到 200 μL 塑料移液器吸头中。将吸液器的一端保持在移液器吸头中，使用吸液器的一端将吸尘器向前推，头朝下，朝向移液器吸头的窄端。
- 使用剃须刀片修剪两端（即动物的前部和后部）的移液器吸头。
- 使用粘土或一小块棉花将苍蝇进一步向前推，直到头部的一半从修剪过的移液器吸头末端突出。使用镊子轻轻推动，直到头部前部的标签暴露出来。
- 使用粘土将修剪好的移液器吸头固定在玻璃显微镜载玻片上（图1）。
- 在立体显微镜下，将标签物横向放置在盖玻片上，使一个叶及其 31 个味觉感受器暴露出来（图 1）。盖玻片将标签固定在适当的位置。
6. 电生理设备
- 为钻机设置选择一个温度和相对湿度稳定 （<70%），并与电气和机械噪声源（如冰箱和离心机）隔离的房间。
- 将显微镜放在防振台的中心。
- 将手动显微操纵器固定在防振台上（图 2）。
- 将固定钨参比电极的不锈钢轴连接到手动显微操纵器（图 2）。
- 使用支架将电动机械手（一个带有用于记录电极探头的支架，另一个带有连接到用于玻璃刺激毛细管的不锈钢轴的支架）连接到同一桌子上（图 2）。
- 将记录电极探头连接到智能数据采集控制器 （IDAC） 系统或其他 amp升压器/数字化器系统。
- 将此IDAC系统链接到工作站上的计算机。
- 将手动和电动机械手接地到钻机内的同一位置。
- 在计算机上安装适用于IDAC系统的采集软件。确保数字采集驱动程序与计算机上的操作系统（例如 Windows XP-7、Windows XP-8 或 Windows XP-10）兼容。
7. 从味觉感受器记录
- 将制备载玻片放在显微镜载物台上，将低放大倍率（例如，10x）物镜放置到位。在低放大倍率和高放大率（例如，50 倍）物镜下，移动载物台，直到标签聚焦在视野中心。
- 使用低倍率物镜将参比电极插入眼睛。要插入参比电极，请将眼对准苍蝇与记录电极相对的一侧，例如ample，如果记录电极从右侧接近，则将参比电极放在左眼中。使用手动显微操作器进行精确插入。
- 使用电动显微操纵器，将玻璃刺激毛细管的尖端聚焦在低放大倍率和高放大倍率物镜的视野中心（图3）。
- 在低放大倍率下，使用第二个电动显微操纵器将记录电极靠近标签。
- 在高放大倍率下，使用电动显微操纵器将记录电极插入味觉传感器的基部，直到听到来自 IDAC 系统音频输出的神经元放电活动的声音。
- 一旦建立了稳定的信号，就开始使用IDAC系统附带的软件记录信号（图4A-D）。要开始录制，请按开始录制按钮。
- 使用电动操纵器将刺激玻璃毛细管的尖端覆盖味觉感受器的尖端。
- 要结束刺激，请使用电动操纵器从感觉器中取出玻璃刺激毛细管。
- 使用踏板手动标记刺激的开始和结束。踏板连接到IDAC，并通过IDAC促进其与软件的通信，以标记刺激的开始/结束。
第8章 分析
- 使用IDAC系统附带的软件的不同功能，按振幅（如果可能）对尖峰群体进行排序，并分析响应动态。
- 要计算峰值，请左键单击感兴趣的记录，弹出一个窗口供您选择。选择 To Spikes，启动另一个名为 Convert waves to spikes 的窗口。在“新建”字段中输入名称，然后按“确定”按钮。
- 在步骤 8.1.1 的 New 字段中输入名称将转到 Amplitude Histogram 视图。选择要计数的 振幅 ，然后关闭此视图。左键单击以添加计数器。
- 手动检查尖峰，以确认基于软件分析的结论。
注意：该软件还允许以不同格式导出数据以供进一步分析。
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Representative Results
图4A显示了由感器引起的自发性尖峰。根据振幅，它们分为两类，较大的尖峰来自对苦味化合物敏感的神经元，而较小的尖峰来自对糖有反应的神经元。基因实验证实了刺突振幅与功能特异性之间的关系 4,14,37,38,39 。
图4B 显示了S5感器的苦味敏感神经元对避蚊胺气味的响应;这种反应是在避蚊胺溶液和感器之间没有任何接触的情况下发生的。一个尖峰似乎是中等振幅的，可能是由两个较小的尖峰叠加产生的，一个来自糖神经元，另一个来自机械感觉神经元。
图 4C 显示了苦味刺激和 I1 感器接触后发生的 ON 响应，然后是接触终止后发生的 OFF 响应。并不是说OFF响应的大小（以尖峰/秒为单位）大于ON响应。
图4D 显示了对另一种果蝇（ 果蝇） 的I1感子中的苦味化合物小檗碱的ON和OFF反应。该技术的优点之一是它可以对其他物种（包括蚊子）进行，而无需将任何转基因引入其中。
图 4E 说明了录制过程中可能出现的两个问题。首先，如果标签没有正确固定，它可能会移动，从感觉器的机械感觉神经元产生尖峰。其次，记录电极可能会从感觉器上脱落，这通常是由于标签的移动造成的。在这种情况下，接触会丢失，必须重新插入电极以记录尖峰。
图 1：碱基记录的苍蝇准备。 一个修剪过的移液器吸头，里面有一只雌性苍蝇，标签盒牢固地放在玻璃盖玻片上。（A） 移液器吸头和盖玻片都牢固地固定在粘土堆上。（B） 放在盖玻片上的标签的放大倍数更高。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：电生理学装置设置。 （A） 概述，显示了用于参比电极的手动显微操纵器、用于玻璃刺激毛细管的电动显微操纵器和用于记录电极的电动显微操纵器的位置。（B） 参比电极、玻璃刺激毛细管和记录电极的支架概览。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：标签和感器。 （A） 倒置显微镜下的标签。标签的特写镜头，显示了标签的一个叶的味觉感受器。它还显示了刺激玻璃毛细管，该毛细管靠近称为 L2（大 2 型）的大型感器之一，以及该感器基部的记录电极。（B） 标签感器的可及性。标签显示感器，这些感器很容易被碱基记录所触及，而感器由于它们在我们通常使用的制剂中的位置而难以接近。缩写：A = 前;M = 内侧;P = 后部;L = 横向。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：自发性尖峰、苦涩神经元反应和次优记录的示例迹线。 （A） 自发尖峰的示例迹线。尖峰来自 I1 感器中的苦敏感神经元（红点）和糖敏感神经元（绿点）。在感器的绘图中，苦味、糖和机械感觉神经元分别被涂成红色、绿色和黑色。（B） S5 感器中的苦神经元（红点）对 1 mM 避蚊胺蒸气响应的示例迹线。请注意，小振幅尖峰来自糖神经元和机械感觉神经元，在此示例中，迹线很难通过振幅来区分。缩写：DEET = N，N-二乙基间甲苯酰胺。（C） I1 感器中苦味神经元对 1 mM 苯甲酸地那铵的 ON 和 OFF 响应的示例迹线。在与刺激接触之前（自发发射）、期间（ON 响应）和之后（OFF 响应）都观察到尖峰。缩写：DEN=苯甲酸地那铵。（D） D. virilis 的 I1 感器中苦味神经元对 0.5 mM 小檗碱氯化物的 ON 和 OFF 反应示例迹线。在接触之前、期间和之后都会观察到尖峰。缩写：BER=氯化小檗碱。（E） 次优记录的示例跟踪。在实验过程中，由于标签的移动，接触丢失。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在某些类型的感觉器的记录中，区分不同神经元的尖峰可能具有挑战性。例如，S 和 I sensilla 的糖神经元和机械感觉神经元产生相似振幅的尖峰，因此难以区分它们 4,14。我们发现，使用非常锋利的钨丝记录电极可以减少机械感觉神经元的放电，记录电极的明智放置也是如此。将记录电极插入感器插座的环中（即插入基部但不深）通常会导致机械感觉刺激减少。此外，我们发现，如果记录具有高水平的机械感觉神经元放电，则撤回记录电极并将其放置在相对于感觉器的不同位置通常会导致较低水平的放电。
在整个实验过程中确保记录电极的稳定性是另一个关键问题（见 图4E）。电极位置的机械干扰或偏移会对记录质量产生不利影响。按照上述协议的规定，投入时间和精力进行彻底的准备，是防止标签移动可能导致的挫败感的关键。
我们注意到另一个问题，我们观察到某些化合物从 I-a类 14 的 I 感应器产生 ON 和 OFF 响应。有时，第二次传递刺激会引起 OFF 响应，但不会引起 ON 响应。ON响应降低的原因尚不清楚。
在基础记录中遇到的另一个挑战是，由于它们在标签上的位置，并非所有传感器都易于访问以进行记录。在 31 种标签感应器中，只有 26 种便于记录，这给该技术带来了局限性，如图 3B 所示。然而，原则上，这些感器（I8、I9、I10、L9和S10）可以通过旋转奥林巴斯显微镜机械XY载物台来接近。
最后，我们强调在苍蝇准备方面投入精力的重要性。一只准备充分的苍蝇更有可能在整个实验过程中产生可靠和高质量的记录。此外，蔗糖可作为阳性对照，保证录音质量;它引起了所有标签敏感者的回应。
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Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢 Zina Berman 的支持，感谢 Lisa Baik 对手稿的评论，以及 Carlson 实验室的其他成员进行讨论。这项工作得到了 NIH 资助 K01 DC020145 到 H.K.M.D 的支持;美国国立卫生研究院（NIH）向J.R.C.DC011697授予R01 DC02174、R01 DC04729和R01。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
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