Summary
드물게 사용되는 전기생리학적 기록 방법인 염기 기록은 기존의 기록 방법으로는 검사할 수 없는 맛 코딩의 특징을 분석할 수 있습니다. 또한 염기 기록을 통해 기존의 전기생리학적 방법으로는 연구할 수 없는 소수성 자극에 대한 맛 반응을 분석할 수 있습니다.
Abstract
곤충은 끝에 구멍이 있는 털 또는 센실라(sensilla)를 통해 외부 세계를 맛봅니다. 감각이 잠재적인 먹이 공급원과 접촉하면 먹이 공급원의 화합물이 기공을 통해 들어가 내부의 뉴런을 활성화합니다. 50년 이상 동안 이러한 응답은 팁 녹음이라는 기술을 사용하여 기록되어 왔습니다. 그러나 이 방법은 자극 접촉 전후에 신경 활동을 측정할 수 없고 타탄트가 수용액에 용해되어야 한다는 요구 사항을 포함하여 주요 제한 사항이 있습니다. 여기에서는 이러한 한계를 극복하는 기본 기록이라고 하는 기술에 대해 설명합니다. 기본 기록을 통해 자극 전, 도중, 후의 미각 뉴런 활동을 측정할 수 있습니다. 따라서 미각 자극 후에 발생하는 OFF 반응을 광범위하게 분석할 수 있습니다. 물에 대한 용해도가 매우 낮은 장쇄 페로몬과 같은 소수성 화합물을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 요약하면, 염기 기록은 신경 활동을 측정하는 수단으로서 단일 감각 전기 생리학의 이점(유전 도구 없이도 높은 공간 및 시간 해상도)을 제공하고 기존 팁 기록 기술의 주요 한계를 극복합니다.
Introduction
초파리를 포함한 곤충은 주변 환경에서 복잡한 화학 정보를 추출할 수 있는 정교한 미각 시스템을 타고났습니다. 이 시스템을 통해 다양한 물질의 화학 조성을 식별할 수 있어 영양가가 있는 물질과 해로운 물질을 구별할 수 있습니다 1,2.
이 시스템의 핵심에는 다양한 신체 부위에 전략적으로 위치한 미모 또는 감각으로 알려진 특수 구조가 있습니다. 초파리에서 이 센실라는 파리 머리 1,2,3,4의 주요 미각 기관인 라벨럼과 다리와 날개 1,2,5,6에 있습니다. labellum은 주둥이의 끝에 위치하며 두 개의 엽(4,7,8)을 포함합니다. 각 로브는 짧은, 긴 및 중간 4,7,8로 분류된 31개의 미각 감각으로 덮여 있습니다. 이 센실라에는 각각 2-4개의 미각 뉴런 1,2,9,10이 있습니다. 이 미각 뉴런은 미각 수용체(Gustatory receptor, Gr), 이온성 수용체(Ionotropic receptor, Ir), 소매치기(Pickpocket, Ppk) 및 일시적 수용체 전위(Transient receptor potential, Trp) 유전자 1,2,11,12,13의 구성원을 발현합니다 . 이러한 수용체와 채널의 다양성은 곤충에게 비휘발성 및 휘발성 신호를 포함한 다양한 화학 화합물을 인식할 수 있는 능력을 부여합니다 1,2,14.
50년 이상 동안 과학자들은 팁 레코딩 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24라는 기술을 사용하여 미각 뉴런과 수용체의 반응을 정량화해 왔습니다 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35입니다. 그러나 이 방법에는 큰 제한 사항이 있습니다. 첫째, 신경 활동은 자극과 접촉하는 동안에만 측정할 수 있으며 접촉 전후에 측정할 수 없습니다. 이 제한은 자발적인 스파이킹 활동의 측정을 배제하고 OFF 응답의 측정을 방지합니다. 둘째, 수용액에 용해되는 타스트란트만 테스트할 수 있습니다.
이러한 한계는 거의 사용되지 않는 대체 전기생리학적 기법인 "염기 기록"으로 극복할 수 있습니다. 여기서 우리는 Marion-Poll과 동료들(24)이 사용한 방법에서 채택한 이 기술을 설명하고, 이제 편리하게 측정할 수 있는 중요한 맛 코딩 기능(14)을 보여준다.
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Protocol
다음 프로토콜은 Yale University의 모든 동물 관리 지침을 준수합니다.
1. 파리
- 새로 출현한 파리 10-15마리를 25°C 및 60% 상대 습도에서 12:12 시간의 명암 주기로 신선한 표준 배양 바이알에 넣습니다.
- 생후 3-7 일 된 파리를 사용하십시오.
2. 화학감각 자극
- 사용 가능한 가장 높은 순도의 화학 감각 자극을 얻습니다. 사용할 때까지 공급업체에서 권장하는 대로 보관하십시오.
- 화학 감각 자극을 용해시키고 물 또는 파라핀 오일과 같은 다른 원하는 무독성 용매에 원하는 농도로 희석합니다. 용해된 고체 화합물의 경우 준비된 용액을 최소 1시간 동안 저어줍니다.
3. 유리 자극 모세관
- 피펫 풀러 기기를 사용하여 붕규산 유리 모세관(길이 100mm, 외경 1mm, 내경 0.58mm)에서 자극을 고정하기 위해 유리 모세관을 당깁니다. 3 μm에서 10 μm 사이의 팁 직경을 달성하는 것을 목표로 합니다.
- microloader 피펫 팁을 사용하여 유리 모세관을 선호하는 자극 용액으로 채웁니다. 부드럽게 두드려 제거할 수 있는 거품이 생기지 않도록 주의하십시오.
- 자극이 끝에서 결정화되면 유리 자극 모세관을 청소하거나 교체하십시오.
4. 기준 및 기록 전극
- 텅스텐 막대(직경 127μm, 길이 76.2mm)를 기준 전극과 기록 전극 모두에 사용합니다. 기준 전극 및 기록 전극을 팁에서 약 1μm 직경으로 날카롭게 합니다(이러한 전극의 모양은 Delventhal et al.36) 10% KNO3 (~1M) 용액 또는 10% KOH(1.8M) 용액에 몇 초 동안 반복적으로 담궈.
알림: 이 솔루션에는 이 프로세스를 용이하게 하기 위해 전류(0.3-3mA)가 필요합니다.
5. 기본 녹음을 위한 플라이 준비
- 바이알에서 파리 한 마리를 흡입기로 끌어냅니다. 흡입기를 빼내고 끝에 손가락을 올려 동물을 가두십시오.
- 파리를 200 μL 플라스틱 피펫 팁으로 배출합니다. 흡입기의 끝을 피펫 팁에 유지하면서 끝을 사용하여 플라이를 피펫 팁의 좁은 끝을 향해 머리부터 앞으로 밉니다.
- 면도날을 사용하여 양쪽 끝(즉, 동물의 전방 및 후방)에서 피펫 팁을 자릅니다.
- 점토나 작은 솜 조각을 사용하여 머리의 절반이 다듬어진 피펫 팁 끝에서 튀어나올 때까지 플라이를 더 앞으로 밉니다. 집게를 사용하여 머리 앞쪽의 라벨럼이 노출될 때까지 부드럽게 밉니다.
- 점토를 사용하여 트리밍된 피펫 팁을 유리 현미경 슬라이드에 고정합니다(그림 1).
- 실체현미경 아래에서 표지를 커버 슬립에 측면으로 배치하여 31개의 미각 감각과 함께 하나의 엽이 노출되도록 합니다(그림 1). 커버 슬립은 라벨을 제자리에 고정합니다.
6. 전기생리학 의장
- 온도와 상대 습도(<70%)가 안정적이고 냉장고 및 원심분리기와 같은 전기적 및 기계적 소음원으로부터 격리된 장비 설정을 위한 방을 선택합니다.
- 방진 테이블 중앙에 현미경을 놓습니다.
- 수동 마이크로 조작기를 진동 방지 테이블에 고정합니다(그림 2).
- 텅스텐 기준 전극을 고정하는 스테인리스강 샤프트를 수동 미세 조작기에 부착합니다(그림 2).
- 전동 매니퓰레이터(하나는 기록 전극 프로브용 홀더가 있고 다른 하나는 유리 자극 모세관용 스테인리스강 샤프트에 연결된 홀더가 있는 다른 매니퓰레이터)를 스탠드를 사용하여 동일한 테이블에 연결합니다(그림 2).
- 기록 전극 프로브를 IDAC(Intelligent Data Acquisition Controller) 시스템 또는 다른 증폭기/디지타이저 시스템에 연결합니다.
- 이 IDAC 시스템을 워크스테이션의 컴퓨터에 연결합니다.
- 수동 및 전동 매니퓰레이터를 장비 내의 동일한 위치에 접지합니다.
- 컴퓨터에 IDAC 시스템에 적합한 수집 소프트웨어를 설치합니다. 디지털 수집 드라이버가 컴퓨터의 운영 체제(예: Windows XP-7, -8 또는 -10)와 호환되는지 확인하십시오.
7. taste sensilla에서 녹음하기
- 준비 슬라이드를 현미경 s에 놓습니다.tage 저배율(예: 10x) 대물렌즈가 제자리에 있습니다. 저배율 및 고배율(예: 50x) 대물렌즈에서 라벨럼이 시야 중앙에 초점이 맞춰질 때까지 스테이지를 이동합니다.
- 저배율 대물렌즈를 사용하여 기준 전극을 눈에 삽입합니다. 기준 전극을 삽입하려면 기록 전극이 있는 측면의 반대쪽 플라이 쪽에 있는 눈을 대상으로 합니다(예: 예 : 기록 전극이 오른쪽에서 접근하는 경우 기준 전극을 왼쪽 눈에 배치합니다. 정확한 삽입을 위해 수동 미세 조작기를 사용하십시오.
- 전동식 micromanipulator를 사용하여 저배율 및 고배율 대물렌즈의 시야 중앙에 있는 유리 자극 모세관의 끝부분에 초점을 맞춥니다(그림 3).
- 저배율에서 두 번째 전동 미세 조작기를 사용하여 기록 전극을 라벨럼 가까이로 가져옵니다.
- 고배율에서 IDAC 시스템의 오디오 출력에서 신경 세포 발화 소리가 들릴 때까지 전동 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 녹음 전극을 미각 감각의 베이스에 삽입합니다.
- 안정적인 신호가 설정되면 IDAC 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 신호 기록을 시작합니다(그림 4A-D). 녹음을 시작하려면 녹음 시작 버튼을 누릅니다.
- 자극 유리 모세관의 끝을 가져와 전동 매니퓰레이터를 사용하여 맛 감각의 끝을 덮습니다.
- 자극을 종료하려면 전동 매니퓰레이터를 사용하여 감각에서 유리 자극 모세관을 제거합니다.
- 페달을 사용하여 수동으로 자극의 시작과 끝을 표시하십시오. 페달은 IDAC에 연결되고 소프트웨어와의 통신은 IDAC를 통해 촉진되어 자극의 시작/끝을 표시합니다.
8. 분석
- IDAC 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어의 다양한 기능을 사용하여 진폭(가능한 경우)별로 스파이크 모집단을 정렬하고 반응 역학을 분석합니다.
- 스파이크를 계산하려면 관심 있는 녹화를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 선택할 수 있는 창을 불러옵니다. 스파이크로를 선택하면 웨이브를 스파이크로 변환이라는 다른 창이 시작됩니다. 새로 만들기 필드에 이름을 입력하고 OK 버튼을 누릅니다.
- 8.1.1단계에서 새로 만들기 필드에 이름을 입력하면 진폭 히스토그램 보기로 이동합니다. 계산할 진폭 을 선택한 다음 이 보기를 닫습니다. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 카운터를 추가합니다.
- 스파이크를 수동으로 검사하여 소프트웨어 분석을 기반으로 결론을 확인합니다.
참고: 이 소프트웨어를 사용하면 추가 분석을 위해 다양한 형식으로 데이터를 내보낼 수도 있습니다.
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Representative Results
그림 4A는 감각에서 발생하는 자발적인 스파이크를 보여줍니다. 그들은 진폭에 따라 두 가지 부류로 나뉘며, 더 큰 스파이크는 쓴 화합물에 민감한 뉴런에서 파생되고 작은 스파이크는 당에 반응하는 뉴런에서 파생됩니다. 스파이크 진폭과 기능적 특이성 사이의 관계는 유전자 실험 4,14,37,38,39에 의해 확증되었습니다.
그림 4B 는 DEET의 냄새에 대한 S5 감각의 쓴맛에 민감한 뉴런의 반응을 보여줍니다. 이 반응은 DEET 용액과 센실럼 사이에 어떠한 접촉도 없이 발생했습니다. 하나의 스파이크는 중간 진폭으로 보이며 두 개의 작은 스파이크, 즉 설탕 뉴런과 기계 감각 뉴런의 중첩으로 인해 발생할 수 있습니다.
그림 4C 는 쓴맛 자극과 I1 감각 사이의 접촉 후 발생하는 ON 반응과 접촉 종료 후 발생하는 OFF 반응을 보여줍니다. 스파이크/초로 측정된 OFF 응답의 크기가 ON 응답보다 큰 것은 아닙니다.
그림 4D 는 파리의 다른 종인 Drosophila virilis 의 I1 sensillum에서 추출한 쓴 화합물 berberine에 대한 ON 및 OFF 반응을 보여줍니다. 이 기술의 장점 중 하나는 전이 유전자를 도입할 필요 없이 모기를 포함한 다른 종에 대해 수행할 수 있다는 것입니다.
그림 4E 는 레코딩 중에 발생할 수 있는 두 가지 문제를 보여줍니다. 첫째, 라벨럼이 제대로 고정되지 않으면 움직일 수 있으며, 이로 인해 감각의 기계감각 뉴런에서 스파이크가 생성될 수 있습니다. 둘째, 기록 전극은 종종 labellum의 움직임의 결과로 sensillum에서 빠질 수 있습니다. 이 경우 접점이 끊어지고 스파이크를 기록하기 위해 전극을 다시 삽입해야 합니다.
그림 1: 기본 기록을 위한 비행 준비. 라벨럼이 유리 커버슬립에 단단히 부착된 암컷 파리가 들어 있는 트리밍된 피펫 팁. (A) 피펫 팁과 커버슬립은 모두 점토 더미에 단단히 고정됩니다. (B) 커버슬립에 놓인 labellum의 더 높은 배율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전기생리학 장비 설정. (A) 기준 전극을 위한 수동 미세조작기, 유리 자극 모세관을 위한 전동식 미세조작기, 기록 전극을 위한 전동식 미세조작기의 위치를 보여주는 개요. (B) 기준 전극, 유리 자극 모세관 및 기록 전극에 대한 홀더를 보여주는 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: labellum 및 sensilla. (A) 도립 현미경 아래의 labellum. labellum의 한 엽의 맛 감각을 보여주는 labellum의 클로즈업. 또한 L2(Large type 2)로 알려진 큰 감각 중 하나에 가까운 자극 유리 모세관과 이 감각의 기저부에 있는 기록 전극을 보여줍니다. (B) labellar sensilla의 접근성. 기본 녹음에 쉽게 접근할 수 있는 센실라(sensilla)와 우리가 일반적으로 사용하는 제제에서의 위치 때문에 접근하기 어려운 센실라(sensilla)를 보여주는 labellum. 약어: A = 전방; M = 내측; P = 후방; L = 측면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 자발적인 스파이크, 쓰라린 뉴런 반응 및 최적이 아닌 기록의 예시. (A) 자발적 스파이크의 예시. 스파이크는 쓴맛에 민감한 뉴런(빨간색 점)과 설탕에 민감한 뉴런(녹색 점)에서 발생합니다. 감각(sensillum)을 그리면 쓴맛, 설탕, 기계감각뉴런이 각각 빨간색, 초록색, 검은색으로 채색되어 있습니다. (B) 1mM DEET의 증기에 대한 S5 센실럼의 쓴맛 뉴런(빨간색 점)의 반응 추적 예. 작은 진폭 스파이크는 설탕 뉴런과 기계 감각 뉴런에서 비롯된 것으로, 이 예에서는 트레이스를 진폭으로 구별하기 어렵습니다. 약어: DEET = N,N-디에틸-메타-톨루아미드. (C) I1 센실라의 쓴맛 뉴런에서 1mM 데나토늄 벤조에이트에 대한 ON 및 OFF 반응의 예. 스파이크는 자극과의 접촉 전(자발적 발화), 도중(ON 반응) 및 후(OFF 반응)에 관찰됩니다. 약어: DEN = denatonium benzoate. (D) 0.5mM 베르베린 클로라이드에 대한 D. virilis 의 I1 sensilla에 있는 쓴 뉴런의 ON 및 OFF 반응의 예. 스파이크는 접촉 전, 접촉 중, 접촉 후에 관찰됩니다. 약어: BER = 베르베린 클로라이드. (E) 예시 최적이 아닌 녹음의 추적. labellum의 움직임으로 인해 실험 중간에 접촉이 끊어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
일부 유형의 감각 세포의 녹음에서는 서로 다른 뉴런의 스파이크를 구별하는 것이 어려울 수 있습니다. 예를 들어, S 및 I sensilla의 당 뉴런과 기계 감각 뉴런은 유사한 진폭의 스파이크를 생성하여 구별하기 어렵게 만듭니다 4,14. 우리는 매우 날카로운 텅스텐 기록 전극을 사용하면 기록 전극의 신중한 배치와 마찬가지로 기계 감각 뉴런의 발화가 감소한다는 것을 발견했습니다. 기록 전극을 감각 소켓의 칼라에 삽입하면(즉, 기저부에 삽입되지만 깊지 않음) 종종 기계적 감각 자극이 감소합니다. 또한, 기록이 기계감각 뉴런의 발화 수준이 높은 경우, 기록 전극을 빼내고 감각에 비해 다른 위치에 배치하면 종종 발화 수준이 낮아진다는 것을 발견했습니다.
실험 전반에 걸쳐 기록 전극의 안정성을 보장하는 것은 또 다른 중요한 문제입니다( 그림 4E 참조). 기계적 장애나 전극 위치의 이동은 녹음 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜에 명시된 대로 철저한 준비에 시간과 노력을 투자하는 것은 라벨럼 이동으로 인해 발생할 수 있는 좌절감을 방지하는 데 중요합니다.
우리는 I-a 클래스14의 I sensilla에서 ON 및 OFF 반응을 모두 생성하는 특정 화합물에서 관찰 한 또 다른 문제에 주목합니다. 때때로, 자극의 두 번째 전달은 OFF를 유도하지만 ON 반응은 유도하지 않습니다. 이러한 ON 응답의 감소에 대한 이유는 알려져 있지 않습니다.
베이스 레코딩에서 직면하는 또 다른 문제는 모든 sensilla가 라벨럼의 위치 때문에 레코딩을 위해 쉽게 접근할 수 있는 것은 아니라는 것입니다. 31개의 라벨러 센실라 중 26개만 기록하기 편리하여 그림 3B와 같이 기술에 제한이 있습니다. 그러나 원칙적으로 이러한 센실라(I8, I9, I10, L9 및 S10)는 Olympus 현미경 기계식 XY 스테이지의 회전으로 접근할 수 있습니다.
마지막으로, 우리는 비행 준비에 노력을 투자하는 것의 중요성을 강조합니다. 잘 준비된 파리는 실험 과정 전반에 걸쳐 신뢰할 수 있는 고품질 녹음을 생성할 가능성이 훨씬 더 높습니다. 게다가, 자당은 녹음의 품질을 보장하기 위해 양성 대조군으로 사용될 수 있습니다; 그것은 모든 labellar sensilla로부터 반응을 이끌어냅니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
도움을 주신 Zina Berman, 원고에 대한 의견을 주신 Lisa Baik, 그리고 토론에 참여해 주신 Carlson 연구소의 다른 분들께 감사드립니다. 이 작업은 H.K.M.D.에 대한 NIH 보조금 K01 DC020145 지원되었습니다. NIH는 J.R.C.에 R01 DC02174, R01 DC04729 및 R01 DC011697을 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
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