Summary
電気生理学的記録のめったに使用されない方法である塩基記録は、従来の記録方法では調べることができなかった味覚コーディングの特徴を分析することができます。塩基記録により、従来の電気生理学的手法では研究できない疎水性刺激に対する味覚応答の分析も可能になります。
Abstract
昆虫は、先端に毛穴がある味毛(センシラ)を通して外界を味わっています。センシラムが潜在的な食料源と接触すると、食物源からの化合物が細孔から入り、内部のニューロンを活性化します。50年以上にわたり、これらの応答はチップ記録と呼ばれる技術を使用して記録されてきました。しかし、この方法には、刺激接触の前後に神経活動を測定できないことや、味覚が水溶液に溶ける必要があることなど、大きな制限があります。ここでは、これらの制限を克服するベースレコーディングと呼ばれる手法について説明します。塩基記録により、刺激前、刺激中、刺激後の味覚ニューロンの活動を測定できます。したがって、味覚刺激後に発生するOFF応答の広範な分析が可能になります。水への溶解度が非常に低い長鎖フェロモンなどの疎水性化合物の研究に使用できます。要約すると、塩基記録は、ニューロン活動を測定する手段として単一感覚電気生理学の利点を提供し、遺伝的ツールを必要とせずに高い空間的および時間的分解能を提供し、従来の先端記録技術の主要な制限を克服します。
Introduction
ショウジョウバエを含む昆虫は、周囲から複雑な化学情報を抽出できる洗練された味覚システムに恵まれています。このシステムにより、さまざまな物質の化学組成を識別し、栄養価の高い物質と有害な物質を区別することができます1,2。
このシステムの中核となるのは、味毛またはセンシラと呼ばれる特殊な構造であり、体のさまざまな部分に戦略的に配置されています。ショウジョウバエでは、これらのセンシラは、ハエの頭1,2,3,4の主要な味覚器官であるラベルと、脚と翼1,2,5,6にあります。ラベルは吻の先端に位置し、2つの葉4,7,8を含みます。各葉は、短、長、中間に分類される31の味覚感覚で覆われています4,7,8。これらのセンシラは、それぞれ2〜4個の味覚ニューロン1,2,9,10を収容します。これらの味覚ニューロンは、少なくとも4つの異なる遺伝子ファミリー、すなわち味覚受容体(Gr)、イオン栄養受容体(Ir)、スリ(Ppk)、および一過性受容体電位(Trp)遺伝子1,2,11,12,13のメンバーを発現します.この受容体とチャネルの多様性により、昆虫は、不揮発性と揮発性の両方の手がかりを含む幅広い化合物を認識する能力を備えています1,2,14。
50年以上にわたり、科学者たちは、チップレコーディングと呼ばれる技術を使用して、味覚ニューロンとその受容体の応答を定量化してきました3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35。ただし、この方法には大きな制限があります。第一に、神経活動は刺激との接触中にのみ測定することができ、接触の前後には測定できない。この制限により、自発的なスパイク活動の測定が不可能になり、OFF応答の測定が妨げられます。第二に、水溶液に溶ける味覚のみをテストできます。
これらの制限は、「塩基記録」と呼ばれるめったに使用されない代替電気生理学的手法によって克服できます。ここでは、Marion-Pollら24が使用した方法から採用したこの手法について説明し、14を便利に測定できるようになった重要な味覚コーディング機能を示します。
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Protocol
以下のプロトコルは、イェール大学のすべての動物飼育ガイドラインに準拠しています。
1.ハエ
- 10〜15匹の新しく出現したフライを、25°Cおよび60%の相対湿度で、12:12時間の明暗サイクルで新鮮な標準培養バイアルに入れます。
- 生後3〜7日でハエを使用してください。
2. 化学感覚刺激
- 利用可能な最高の純度の化学感覚刺激を得る。使用するまで、ベンダーの推奨に従って保管してください。
- 化学感覚刺激を溶解し、水またはパラフィン油などの別の所望の無毒溶媒で所望の濃度に希釈する。調製した溶液を、溶解した固体化合物の場合は最低1時間攪拌する。
3.ガラス刺激毛細管
- ピペットプーラー装置を使用して、ガラスキャピラリーを引っ張り、ホウケイ酸ガラスキャピラリー(長さ100 mm、外径1 mm、内径0.58 mm)からの刺激を保持します。先端径3μm〜10μmを目標にしてください。
- マイクロローダーピペットチップを使用して、ガラスキャピラリーに好みの刺激溶液を充填します。気泡は軽く叩くことで取り除くことができますので、ご注意ください。
- 先端で刺激が結晶化した場合は、ガラス刺激毛細管を清掃または交換してください。
4. 基準電極と記録電極
- タングステンロッド(直径127μm、長さ76.2mm)を基準電極と記録電極の両方に使用してください。基準電極と記録電極の先端を直径約1μmに鋭利にします(これらの電極の形状はDelventhalらに描かれています。36)10%KNO3 (~1M)溶液または10%KOH(1.8M)溶液のいずれかに数秒間繰り返し浸漬する。
注意: このソリューションでは、このプロセスを容易にするために電流(0.3〜3 mA)が必要です。
5.ベースレコーディング用のフライの準備
- バイアルから吸引器に1匹のハエを描きます。吸引器を引き出し、端に指を置いて動物を閉じ込めます。
- フライを200μLのプラスチック製ピペットチップに排出します。吸引器の端をピペットチップに入れたまま、端を使用してフライをピペットチップの狭い方の端に向かって頭から前方に押します。
- かみそりの刃を使用して、ピペットの先端を両端(つまり、動物の前後)でトリミングします。
- 粘土または綿の小片を使用して、頭の半分がトリミングされたピペットチップの端から突き出るまで、フライをさらに前方に押します。鉗子を使用して、頭の前部にあるラベルが露出するまでそっと押します。
- トリミングしたピペットチップを粘土を使用してガラス顕微鏡スライドに固定します(図1)。
- 実体顕微鏡の下で、ラベルをカバースリップに横向きに配置し、1つの葉とその31の味覚感覚が露出するようにします(図1)。カバースリップはラベルを所定の位置に保持します。
6. 電気生理学リグ
- リグのセットアップには、温度と相対湿度(<70%)が安定しており、冷蔵庫や遠心分離機などの電気的および機械的ノイズの発生源から隔離された部屋を選択してください。
- 防振テーブルの中央に顕微鏡を置きます。
- 手動マイクロマニピュレータを防振テーブルに固定します(図2)。
- タングステン基準電極を保持するステンレス鋼シャフトを手動マイクロマニピュレータに取り付けます(図2)。
- 電動マニピュレータ(1台は記録電極プローブ用のホルダー付き、もう1台はガラス刺激キャピラリー用のステンレス製シャフトにホルダーを接続したもの)をスタンドを使用して同じテーブルに接続します(図2)。
- 記録電極プローブをインテリジェントデータ収集コントローラー(IDAC)システムまたは別のアンプ/デジタイザーシステムに接続します。
- このIDACシステムをワークステーションのコンピューターにリンクします。
- 手動マニピュレータと電動マニピュレータをリグ内の同じ場所に接地します。
- IDACシステムに適した集録ソフトウェアをコンピュータにインストールします。デジタル集録ドライバがコンピュータのオペレーティングシステム(Windows XP-7、-8、-10など)と互換性があることを確認します。
7.味覚センシラからの録音
- 試料作製スライドを顕微鏡ステージに置き、低倍率(10倍など)の対物レンズを所定の位置に置きます。低倍率対物レンズと高倍率対物レンズ(50倍など)の両方で、視野の中心にラベルが焦点を合わせるまでステージを移動します。
- 低倍率対物レンズを使用して参照電極を眼に挿入します。参照電極を挿入するには、記録電極が右から近づいてくる場合は、参照電極を左目に置くなど、記録電極と反対側のフライの側の目をターゲットにします。手動マイクロマニピュレーターを使用して、正確な挿入を行います。
- 電動マイクロマニピュレータを使用して、ガラス刺激キャピラリーの先端を低倍率対物レンズと高倍率対物レンズの両方の視野の中心に焦点を合わせます(図3)。
- 低倍率で、2番目の電動マイクロマニピュレータを使用して記録電極をラベルに近づけます。
- 高倍率下で、IDACシステムのオーディオ出力からのニューロンの発火活動の音が聞こえるまで、電動マイクロマニピュレータを使用して記録電極を味覚感覚の基部に挿入します。
- 安定した信号が確立されたら、IDACシステムに付属のソフトウェアを使用して信号の記録を開始します(図4A-D)。録音を開始するには、[録音開始]ボタンを押します。
- 刺激ガラス毛細管の先端を、電動マニピュレータを使用して味覚の先端を覆うように持ってきます。
- 刺激を終了するには、電動マニピュレータを使用してガラス刺激毛細管をセンシラムから取り外します。
- ペダルを使用して手動で刺激の開始と終了をマークします。ペダルはIDACに接続されており、ソフトウェアとの通信はIDACを介して促進され、刺激の開始/終了をマークします。
8. 分析
- IDACシステムに付属するソフトウェアのさまざまな機能を使用して、スパイク母集団を振幅(可能な場合)でソートし、応答ダイナミクスを分析します。
- スパイクをカウントするには、関心のある記録を左クリックし、ウィンドウを表示して選択します。[スパイクへ] を選択し、[波をスパイクに変換] という名前の別のウィンドウを開始します。[新規]フィールドに名前を入力し、[OK]ボタンを押します。
- ステップ8.1.1で New フィールドに名前を入力すると、 Amplitude Histogram ビューが表示されます。カウントする 振幅 を選択し、このビューを閉じます。左クリックすると、カウンタが追加されます。
- スパイクを手動で調べて、ソフトウェアによる分析に基づいて結論を確認します。
注:このソフトウェアでは、さらに分析するためにさまざまな形式でデータをエクスポートすることもできます。
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Representative Results
図4Aは、感覚から生じる自発的なスパイクを示しています。それらは振幅に基づいて2つのクラスに分類され、大きなスパイクは苦味化合物に敏感なニューロンに由来し、小さなスパイクは糖に反応するニューロンに由来します。スパイク振幅と機能特異性の関係は、遺伝子実験によって裏付けられています4,14,37,38,39。
図4B は、DEETの匂いに対するS5感覚の苦味感受性ニューロンの応答を示しています。この応答は、DEET溶液と感覚の間に接触することなく起こりました。1つのスパイクは中程度の振幅であるように思われ、糖ニューロンからのスパイクと機械感覚ニューロンからのスパイクの2つの小さなスパイクの重ね合わせに起因する可能性があります。
図4C は、苦い刺激とI1感受性との間の接触後に発生するON応答と、接触の終了後に発生するOFF応答を示す。スパイク/秒で測定されたオフ応答の大きさがオン応答よりも大きいわけではありません。
図4D は、別の種のハエである ショウジョウバ エのI1センシラム由来の苦味化合物ベルベリンに対するONおよびOFF応答を示しています。この技術の利点の1つは、蚊を含む他の種に対して、導入遺伝子を導入することなく実行できることです。
図 4E は、記録中に発生する可能性のある 2 つの問題を示しています。まず、ラベルが適切に固定されていないと、ラベルが移動し、感覚の機械感覚ニューロンからスパイクが生成されます。第二に、記録電極は、多くの場合、ラベルの動きの結果として、感覚から外れる可能性があります。この場合、接触が失われ、スパイクを記録するために電極を再挿入する必要があります。
図1:ベースレコーディングのためのフライの準備。 ラベルがガラスのカバースリップにしっかりと配置されたメスのハエを含むトリミングされたピペットチップ。(A)ピペットチップとカバーガラスの両方が粘土の山にしっかりと保持されています。(B)カバーガラスの上に置かれたラベルのより高い倍率。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:電気生理学リグのセットアップ(A)参照電極用の手動マイクロマニピュレータ、ガラス刺激キャピラリー用の電動マイクロマニピュレータ、および記録電極用の電動マイクロマニピュレータの位置を示す概要。(B)参照電極、ガラス刺激キャピラリー、および記録電極のホルダーを示す概要。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:ラベラムとセンシラ(A)倒立顕微鏡下でのラベラム。ラベルの片葉の味感を示すラベルのクローズアップ。また、L2(大型タイプ2)と呼ばれる大きなセンシラの1つに近い刺激ガラスの毛細管と、このセンシラムの基部にある記録電極も示しています。(B)labellar sensillaのアクセシビリティ。ラベルには、ベースレコーディングに簡単にアクセスできるセンシラと、私たちが一般的に使用する準備における位置のためにアクセスしにくいセンシラが表示されます。略語:A =前部。M =内側;P =後部;L =横方向。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:自発的スパイク、苦いニューロン反応、および最適でない記録の痕跡の例。スパイクは、I1感覚の苦味感受性ニューロン(赤い点)と糖感受性ニューロン(緑の点)からのものです。感覚の描画では、苦い、砂糖、および機械感覚ニューロンは、それぞれ赤、緑、および黒に着色されています。(B)1 mM DEETの蒸気に対するS5感知細胞の苦いニューロン(赤い点)の応答の痕跡の例。小さな振幅のスパイクは、糖ニューロンと機械感覚ニューロンからのものであり、この例では振幅で区別するのが難しいトレースであることに注意してください。略語:DEET = N、N-ジエチル-メタ-トルアミド。(C)I1センシラの苦いニューロンから1 mM安息香酸デナトニウムに対するONおよびOFF応答の痕跡の例。スパイクは、刺激との接触前(自発)、中(ON反応)、および接触後(OFF反応)に観察されます。略語:DEN =安息香酸デナトニウム。(D)D. virilisのI1センシラの苦いニューロンから0.5 mMの塩化ベルベリンに対するONおよびOFF応答の痕跡の例。スパイクは、接触前、接触中、接触後に観察されます。略称:BER =塩化ベルベリン。(E)最適でない記録のトレースの例。実験の途中で、ラベルの動きにより接触が失われました。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ある種のセンシラからの記録では、異なるニューロンのスパイクを区別することが困難な場合がある。例えば、S感知器とI感知器の糖ニューロンと機械感覚ニューロンは、同様の振幅のスパイクを生成し、それらを区別することを困難にする4,14。非常に鋭いタングステン記録電極を使用すると、記録電極の賢明な配置と同様に、機械感覚ニューロンの発火が減少することがわかりました。記録電極をセンシラムソケットのカラー(つまり、ベースに挿入するが深くない)すると、機械感覚刺激が減少することがよくあります。さらに、記録に機械感覚ニューロンの発火レベルが高い場合、記録電極を引っ込めて感覚に対して異なる位置に配置すると、発火レベルが低下することが多いことがわかりました。
実験全体を通して記録電極の安定性を確保することも重要な問題です( 図4Eを参照)。機械的な乱れや電極位置のずれは、記録の品質に悪影響を与える可能性があります。上記のプロトコルで指定されているように、徹底的な準備に時間と労力を費やすことは、ラベルの動きから生じる可能性のあるフラストレーションを防ぐための鍵です。
I-aクラス14のI sensillaからON応答とOFF応答の両方を生成する特定の化合物で観察されたもう1つの問題に注目します。時々、刺激の2回目の配信はオフを誘発しますが、オンの反応は引き出しません。この ON 応答の低下の理由は不明です。
ベースレコーディングで遭遇するもう一つの課題は、ラベル上の位置のために、すべてのセンシラが録音のために簡単にアクセスできるわけではないことです。31個のlabellar sensillaのうち、26個だけが記録に便利であり、 図3Bに示すように、この技術に限界がある。ただし、原則として、これらのセンシラ(I8、I9、I10、L9、およびS10)は、オリンパスの顕微鏡機械式XYステージを回転させることでアクセス可能になります。
最後に、フライの準備に努力を注ぐことの重要性を強調します。よく準備されたハエは、実験の過程で信頼性が高く高品質の記録が得られる可能性がはるかに高くなります。さらに、スクロースは、記録の品質を確保するためのポジティブコントロールとして使用できます。それはすべてのラベルセンシラから反応を引き出す。
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Disclosures
著者には、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
サポートしてくれたZina Berman、原稿にコメントしてくれたLisa Baik、そして議論をしてくれたCarlson研究室の他のメンバーに感謝します。この研究は、H.K.M.D.へのNIH助成金K01 DC020145を支援しました。NIHはR01 DC02174、R01 DC04729、およびR01 DC011697をJ.R.C.に付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
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