Summary
Il protocollo utilizza la microscopia avanzata a foglio di luce insieme a metodi di pulizia dei tessuti adattati per studiare strutture cardiache complesse nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.
Abstract
La microscopia a foglio luminoso (LSM) svolge un ruolo fondamentale nella comprensione dell'intricata struttura tridimensionale (3D) del cuore, fornendo informazioni cruciali sulla fisiologia cardiaca fondamentale e sulle risposte patologiche. Approfondiamo lo sviluppo e l'implementazione della tecnica LSM per chiarire la microarchitettura del cuore nei modelli murini. La metodologia integra un sistema LSM personalizzato con tecniche di pulizia dei tessuti, mitigando la dispersione della luce all'interno dei tessuti cardiaci per l'imaging volumetrico. La combinazione di LSM convenzionale con approcci di cucitura delle immagini e deconvoluzione multiview consente l'acquisizione dell'intero cuore. Per affrontare il compromesso intrinseco tra risoluzione assiale e campo visivo (FOV), introduciamo inoltre un metodo di microscopia a foglio luminoso a scansione assiale (ASLM) per ridurre al minimo la luce sfocata e illuminare uniformemente il cuore attraverso la direzione di propagazione. Nel frattempo, i metodi di pulizia dei tessuti come iDISCO migliorano la penetrazione della luce, facilitando la visualizzazione delle strutture profonde e garantendo un esame completo del miocardio in tutto il cuore. La combinazione dei metodi LSM e di pulizia dei tessuti proposti presenta una piattaforma promettente per i ricercatori nella risoluzione delle strutture cardiache nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.
Introduction
L'insufficienza cardiaca rimane la principale causa di mortalità in tutto il mondo, principalmente a causa della mancanza di capacità rigenerativa dei cardiomiociti maturi1. L'intricata architettura del cuore svolge un ruolo cruciale nella sua funzione e fornisce informazioni sui processi di sviluppo. Una profonda comprensione della struttura cardiaca è essenziale per chiarire i processi fondamentali della morfogenesi cardiaca e del rimodellamento in risposta all'infarto del miocardio. Recenti progressi hanno dimostrato che i topi neonatali possono ripristinare la funzione cardiaca dopo una lesione, mentre i topi adulti mancano di tale capacità rigenerativa2. Ciò stabilisce una base per lo studio dei segnali associati ad anomalie strutturali e funzionali nei modelli murini. I metodi di imaging tradizionali, come la microscopia confocale, presentano limitazioni tecniche, tra cui una profondità di penetrazione limitata, uno schema di scansione a punti lento e danni fotografici dovuti all'esposizione prolungata alla luce laser. Questi ostacolano l'imaging tridimensionale completo (3D) del cuore intatto. In questo contesto, la microscopia a foglio luminoso (LSM) emerge come una soluzione potente, che offre i vantaggi dell'imaging ad alta velocità, la riduzione dei danni fotografici e le eccezionali capacità di sezionamento ottico 3,4,5. Le caratteristiche uniche dell'LSM lo posizionano come un metodo promettente per superare i limiti delle tecniche convenzionali, fornendo informazioni senza precedenti sullo sviluppo cardiaco e sui processi di rimodellamento 6,7,8.
In questo protocollo, introduciamo una strategia di imaging che combina LSM avanzato con approcci di pulizia tissutale adattati9, consentendo l'imaging di interi cuori di topo senza la necessità di una marcatura specifica e di un sezionamento meccanico. Proponiamo inoltre che l'imaging LSM convenzionale possa essere migliorato attraverso la deconvoluzione multiview10 o le tecniche di microscopia a foglio di luce a scansione assiale (ASLM) 11,12,13,14,15 per migliorare la risoluzione assiale. Inoltre, l'integrazione dell'unione delle immagini con uno di questi metodi può superare efficacemente il compromesso tra risoluzione spaziale e campo visivo (FOV), facendo così progredire l'imaging dei cuori di topo adulto. L'incorporazione di numerosi approcci di pulizia dei tessuti, inclusi metodi idrofobici, idrofili e basati su idrogel, consente una penetrazione della luce più profonda per catturare la morfologia dell'intero cuore 16,17,18,19.
Sebbene i metodi di purificazione multipli siano compatibili con gli attuali sistemi LSM, l'obiettivo è ridurre al minimo la dispersione dei fotoni e migliorare la penetrazione della luce nei tessuti, come il cuore, sostituendo i lipidi con un mezzo che corrisponda strettamente al suo indice di rifrazione. iDISCO è stato scelto come rappresentante20,21 e adattato per l'imaging in autofluorescenza in questo protocollo grazie alla sua rapida elaborazione e all'elevata trasparenza (Figura 1A). Nel complesso, l'integrazione dell'approccio LSM avanzato con le tecniche di pulizia dei tessuti offre un quadro promettente per svelare l'intricata anatomia cardiaca nei cuori dei roditori, con un potenziale significativo per far progredire la nostra comprensione della morfogenesi e della patogenesi cardiaca.
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Protocol
I protocolli e gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e condotti sotto la supervisione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas a Dallas (IACUC # 21-03). In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL6, inclusi neonati al giorno 1 postnatale (P1) e adulti di 8 settimane. Non è stata osservata alcuna differenza tra maschi e femmine. Tutta l'acquisizione dei dati e la post-elaborazione delle immagini sono state effettuate utilizzando software o piattaforme open source con licenze di ricerca o didattiche. Le risorse sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta.
1. Preparazione del campione e pulizia dei tessuti (6 - 10 giorni)
- Preparare tutte le soluzioni chimiche nella tabella dei materiali necessarie per il metodo di pulizia dei tessuti prima di iniziare la procedura di pulizia dei tessuti.
NOTA: Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante indossando adeguati dispositivi di protezione individuale, soprattutto quando si maneggiano sostanze chimiche tossiche. - Sopprimere gli animali con CO2 mettendoli in una camera di CO2 nei punti temporali desiderati, come P1 e 8 settimane, per la raccolta dell'intero cuore e immergere il cuore appena isolato a temperatura ambiente (RT) in 0,2 M KCl per arrestare in diastole16.
- Fissare il cuore immergendolo in paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con una leggera agitazione su un bilanciere durante la notte per preservare l'anatomia cardiaca a 4 °C, vedere la Tabella 1.
ATTENZIONE: Il PFA è una sostanza chimica tossica e deve essere eseguito sotto una cappa aspirante. - Lavare il cuore con 1x PBS a RT per 30 min, 3x.
NOTA: Opzionale: incorporare il cuore nel gel di agarosio per creare un gruppo cuore per il sistema LSM personalizzato nel passaggio 2 come descritto di seguito.- Preparare la soluzione di agarosio all'1% sciogliendo l'agarosio in PBS e scaldare la miscela nel microonde fino a completa dissoluzione. Versare la soluzione in uno stampo per creare uno strato inferiore fino a quando la soluzione non si raffredda a 40 °C.
- Mettere il cuore nello stampo e riempire lo stampo con gel di agarosio fino a quando non si solidifica. Eliminare eventuali bolle nel gel di agarosio per ridurre al minimo gli artefatti nell'imaging.
NOTA: L'inclusione del campione riduce il rischio di potenziali danni all'anatomia del cuore durante il montaggio.
ATTENZIONE: Utilizzare l'agarosio a basso punto di fusione ed evitare di mettere il cuore direttamente nell'agarosio riscaldato per mitigare il rischio di esporre il campione a temperature elevate.
- Disidratare il cuore utilizzando gradienti di metanolo miscelato con acqua deionizzata (Figura 1B), elaborando attraverso concentrazioni sequenziali del 20%, 40%, 60%, 80% e 100% come indicato nella Tabella 1. Ripetere con metanolo fresco al 100% 1 volta per garantire la completa disidratazione. Disidratare i cuori di topo neonatale per 1 ora in ciascuna miscela di metanolo agitando. Regolare il tempo di incubazione a 2 ore per cuori di topo e cuori di ratto di 8 settimane.
ATTENZIONE: Il metanolo è una sostanza chimica volatile, irritante e infiammabile. - Sostituire e raffreddare il cuore con metanolo fresco al 100% per 10 minuti a 4 °C.
- Sostituire la soluzione e sbiancare il cuore con perossido di idrogeno al 5% (H2O2) in metanolo utilizzando un rapporto in volume di 1:5 (30% H2O2 a 100% di metanolo) per una notte a 4 °C per rimuovere i pigmenti.
NOTA: La rimozione dei pigmenti consente di ridurre al minimo l'assorbimento dei fotoni, portando a una migliore qualità dell'immagine con artefatti ridotti. - Sostituire la soluzione e incubare il cuore in metanolo al 100% per 1 ora a RT.
- Delipidate il cuore con la soluzione contenente il 66% di diclorometano (DCM) e il 33% di metanolo per 3 ore agitando. Assicurarsi che il cuore affondi sul fondo della fiala entro la fine di questo passaggio. In caso contrario, rinnovare la soluzione (66% DCM / 33% metanolo) e prolungare il tempo di incubazione (ad es. 1 ora in più) per ottenere la completa delipidazione. Trasferisci rapidamente il cuore in una soluzione fresca per evitare l'essiccazione, poiché il DCM è altamente volatile.
ATTENZIONE: Utilizzare polipropilene o vetreria per l'esperimento, poiché DCM non è compatibile con il polistirolo. - Utilizzare l'etere dibenzilico (DBE) per la corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI = 1,56). Per i cuori di topo neonatale, il processo di corrispondenza dell'indice di rifrazione richiede 2 giorni, mentre per i cuori di topo di 8 settimane occorrono 5 giorni con un leggero scuotimento. Sostituiscilo con DBE fresco e prolunga il tempo di incubazione fino a quando il cuore non raggiunge la completa trasparenza.
ATTENZIONE: Il DBE è pericoloso. Evitare qualsiasi contatto con la pelle.
2. Montaggio del campione (1 giorno)
NOTA: Nel caso in cui venga utilizzato un sistema LSM commerciale, seguire il protocollo specifico fornito dall'azienda per riparare il cuore e saltare i passaggi 2.1 - 2.9.
- Personalizza una camera e un supporto resistenti alla soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (ad esempio, DBE nell'approccio iDISCO adattato) utilizzando una stampante 3D e materiali Onyx (Figura 2A)16.
- Fissare un magnete sul fondo della camera per facilitare il collegamento rapido e la localizzazione accurata sotto il sistema LSM (Figura 2B).
- Fissare occhiali di copertura da 25 mm x 50 mm x 0,17 mm alla camera utilizzando colla siliconica trasparente e verificare l'integrità impermeabile della camera riempiendola con DBE e verificando la presenza di perdite dopo 1 giorno.
- Personalizza un supporto per morsetto utilizzando una stampante 3D e apposta un magnete per montare il gruppo cuore all'interno della camera (Figura 2C) o inserire un ago nel gel di agarosio per montare il gruppo cuore.
- Effettuare lo sviluppo di un sistema LSM interno utilizzando una lente cilindrica e laser a stato solido pompati a diodi a onda continua (DPSS) come precedentemente riportato16,22. Utilizzare la lunghezza d'onda di eccitazione di 532 nm per catturare l'autofluorescenza dal miocardio (Figura 2D).
- Montare la camera su un tavolino a 6 dimensioni e individuare la posizione ottimale in cui la camera è perpendicolare alla direzione di propagazione del laser.
- Utilizzare un supporto a morsetto magnetico per posizionare il campione al centro della camera e collegare il supporto a un tavolino motorizzato a 4 dimensioni (X, Y, Z e Imbardata; Figura 2D).
- Immergere il gruppo cuore nella camera riempita di DBE utilizzando il tavolino motorizzato e determinare il raggio di scansione lungo l'asse di rilevamento (direzione Z).
- Determinare la velocità di scansione (V,z) del motore lungo la direzione Z in base alla dimensione del passo (S) e al tempo di acquisizione di un'immagine (T) utilizzando la seguente equazione:
NOTA: La relazione tra la dimensione del passo e la risoluzione assiale del sistema di imaging aderisce al teorema di campionamento di Nyquist-Shannon. Ad esempio, la dimensione del passo è stata fissata a 1 μm, dato che la risoluzione assiale era di 2,91 μm, come indicato nel precedente rapporto16. - Per verificare la risoluzione spaziale e ridurre al minimo i potenziali problemi di opacità a diverse profondità, misurare la funzione di diffusione puntuale (PSF) del sistema mediante imaging di microsfere fluorescenti con il diametro di 0,53 μm diluite in gel di agarosio a basso punto di fusione all'1% con una concentrazione di 1:1,5 x 105. Calcolare la PSF sull'intero campione misurando l'intera larghezza a metà massimo (FWHM)16.
3. Stitching dell'immagine (4-8 ore)
- Calcola il numero di tessere necessarie per coprire l'intero cuore del mouse, considerando il FOV limitato. Per ogni piastrella, le dimensioni corrispondono al FOV del sistema LSM. Ad esempio, un cuore di topo neonatale con una sezione trasversale di 3 x 3,6 mm2 richiede 2 x 2 piastrelle per la copertura nell'LSM personalizzato (Figura 3A). Al contrario, un cuore di topo di 8 settimane che misura 5 x 8 mm2 richiede 3 x 4 tessere per coprire l'intera struttura cardiaca (Figura 3B).
NOTA: Lo stitching dell'immagine è necessario se l'LSM convenzionale ha un FOV limitato per l'imaging dell'intero cuore. - Cattura immagini del cuore partendo dalla tessera 1, ovvero la piastrella nell'angolo in alto a sinistra del cuore (Figura 3A-B).
- Acquisire in sequenza le immagini delle tessere rimanenti con una sovrapposizione del 10% tra tessere consecutive fino a coprire l'intero cuore, come illustrato nella Figura 3C.
- Scarica e installa il software open source Fiji23 . Scarica e installa il plug-in Fiji, BigStitcher24.
- Vai al menu Aiuto, seleziona Aggiorna, scegli Gestisci sito di aggiornamento e opta per BigStitcher. Successivamente, fare clic su Chiudi, quindi su Applica modifiche. Al termine del download del plug-in, riavvia il software Fiji.
- Apri il plug-in BigStitcher e importa tutte le tessere necessarie attraverso la directory del file immagine. Salvare il set di dati come file HDF5.
- Organizza le tessere scegliendo Sposta tessera per griglia normale, seleziona il motivo utilizzato per spostare il cuore e seleziona una sovrapposizione del 10% tra ogni tessera. Cucire le tessere usando l'opzione Procedura guidata di unione.
- Esporta i dati uniti usando Image Fusion, per generare un file tiff.
4. Deconvoluzione multiview (5 giorni)
- Utilizzare perline fluorescenti per la registrazione dell'immagine della ricostruzione multiview lungo il cuore (Figura 3D).
- Preparare la resina25 mescolando bisfenolo-A diglicidil etere (D.E.R. 332), isoforone diammina, 5-ammino-1,3,3-trimetilcicloesandmetilammina (IPDA) e propilenico glicole diglicidil etere (D.E.R. 736) con un rapporto di volume di 4:1:1.
- Centrifugare 10 μL di microsfere di fluorescenza a 161 x g per 5 minuti e aggiungere 20 μL di metanolo per sostituire la soluzione di conservazione delle microsfere. Ripetilo 3 volte.
- Preparare una soluzione da 10 mL con concentrazione di microsfere 1:1 x 105 mescolando la soluzione di microsfere a base di metanolo nella resina preparata al punto 4.1.1.
- Degasare la soluzione in una camera a vuoto per 3 ore per rimuovere sacche d'aria e bolle.
- Versare la soluzione in uno stampo in silicone o in una cannuccia di plastica e attendere 2 o 3 giorni finché non si solidifica. Dopo 1 giorno prima che la resina diventi solida, metti il tubo di vetro all'interno dello stampo e attendi che il tubo si attacchi alla resina. Rimuovere la resina dallo stampo con il tubo di vetro (Figura 3D).
- Metti il cuore nel tubo di vetro, riempilo di DBE e monta il tubo di vetro nella camera riempita di DBE.
- Acquisire immagini sequenziali del cuore del topo insieme alle perline dalla sezione illuminata scansionando il gruppo cuore lungo l'asse di rilevamento (asse Z; Figura 3E-F).
NOTA: Implementa l'unione delle immagini nel passaggio 3 per generare singole pile di immagini se la dimensione del cuore supera il FOV. - Ruotare il cuore del mouse di 60° lungo l'asse Y per acquisire le pile successive da più angolazioni, ad esempio 0°, 60°, 120°, 180°, 240° e 300° (Figura 3E-F).
- Apri il plugin BigStitcher e importa tutte le immagini attraverso la directory dei file immagine. Salvare il set di dati come file HDF5.
- Scegli Rileva punti di interesse e seleziona manualmente le perline di interesse per la registrazione.
- Selezionare Modello di trasformazione affine per la registrazione. Selezionate Funzione diffusione punti (Point Spread Function) e assegnate PSF a tutte le viste.
- Fare clic su Deconvoluzione multivista e scegliere il tipo di iterazione come Bayesiana efficiente. Definire Numero di iterazioni come 10 ed eseguirlo26.
- Fare clic su Image Fusion per esportare un file tiff .
NOTA: Informazioni più dettagliate sulla deconvoluzione multiview possono essere trovate in altri rapporti o protocolli 24,27,28.
5. Hardware del sistema a foglio leggero a spazzamento assiale (1 giorno)
- Installare una lente sintonizzabile elettrica (ETL) sul piano di Fourier della lente cilindrica (CL)27 (Figura 2D) per scansionare il raggio laser assialmente14. Assicurarsi che l'interfaccia del liquido in ETL sia orizzontale per evitare la distorsione del fronte d'onda causata dalla gravità. Allineare l'ETL con precisione per ridurre al minimo il decentramento del fascio e le aberrazioni ottiche di ordine superiore30.
- Installare una scheda DAQ nella workstation e collegare un cavo BNC alla scheda DAQ per sincronizzare l'esposizione della telecamera e la scansione ETL.
- Aprire l'alloggiamento del driver ETL e rimuovere il coperchio (Figura 4).
- Saldare il filo del segnale del cavo BNC al pin analogico in B, come indicato nella parte inferiore della scheda PCB (Figura 4).
- Saldare il filo di terra del cavo BNC al pin GND; quindi collegare l'altra estremità del cavo BNC all'AO (uscita analogica) nella scheda DAQ (Figura 4).
- Collegare il driver ETL alla porta USB della workstation, collegare il driver all'ETL utilizzando un cavo hirose e installare il software di controllo del driver dell'obiettivo.
- Modificare la modalità di funzionamento nel software del controller del driver dell'obiettivo in analogico per controllare l'ETL con un trigger generato dalla scheda DAQ.
- Nel software della fotocamera sCMOS, impostare la modalità di acquisizione su Esterno (foglio luminoso). Assicurarsi che la direzione di scansione dei pixel attivi sia perpendicolare alla direzione di scansione laser per facilitare la sincronizzazione.
- Collegare la porta trigger esterna sul retro della fotocamera sCMOS all'AO della scheda DAQ utilizzando un cavo BNC (Figura 4).
6. Sincronizzazione del sistema di fogli leggeri a spazzata assiale (7 giorni)
- Definire il tempo di esposizione in base al rapporto segnale/fondo accettabile (SBR) che per lo studio proposto è almeno 10. Aumentare il tempo di esposizione se SBR è inferiore a 10.
NOTA: Il tempo di esposizione compreso tra 10 e 50 ms fornisce un SBR accettabile in questo progetto. - Definire il tempo di acquisizione di un'immagine (T) e l'intervallo di linea (L) in base al tempo di esposizione (E) per la fotocamera e alla frequenza ETL (f) utilizzando le seguenti equazioni:
Dove P indica il numero di colonne di pixel sul sensore della fotocamera. I parametri rappresentativi per il riferimento sono rispettivamente f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms e L = 243 μs. - Nel programma LabVIEW Trigger Generator.vi, genera trigger quadrati e triangolari per la sincronizzazione (Figura 5).
NOTA: Il programma LabVIEW personalizzato è disponibile presso gli autori su ragionevole richiesta. - Montare perle fluorescenti diluite in gel di agarosio 16 a basso punto di fusioneall'1% con una concentrazione di 1:1 x 103 per individuare la posizione della vita del raggio nell'immagine (Figura 6A).
- Nel programma, identificare i punti di inizio e fine del raggio laser sotto il FOV modificando la tensione lungo la direzione di scansione.
- Per sincronizzare la fotocamera sCMOS e l'ETL, scansionare il raggio laser lungo l'asse X e i pixel attivi lungo l'asse Y per generare un'immagine 2D (Figura 6B). Le perline più luminose e nitide lungo la diagonale nell'immagine indicano la precisa sincronizzazione tra sCMOS ed ETL.
NOTA: La sincronizzazione della velocità di scansione dell'attivazione dei pixel ETL e sCMOS è fondamentale per la qualità dell'immagine. Vari errori asincroni comuni sono riepilogati nella Figura 6C-F. - Dopo aver determinato i parametri di sincronizzazione ottimali per la sincronizzazione, ruotare la fotocamera sCMOS di 90° attorno all'asse Z per allineare la direzione dei pixel attivi con la direzione della scansione laser.
- Ripetere il passaggio 2.10 e misurare l'FWHM della PSF. Utilizzare lo stesso metodo indicato nel precedente rapporto16, con le risoluzioni laterali e assiali medie dell'ASLM rispettivamente di 2,18 μm e 2,88 μm (Figura 7).
NOTA: L'illuminazione e la risoluzione uniformi su tutto il FOV sono possibili in condizioni ideali (Figura 7A-B). Il funzionamento asincrono dell'ETL con la telecamera sCMOS, così come il disallineamento dell'illuminazione e del rilevamento, possono causare una risoluzione spaziale non uniforme (Figura 7C-D). - Per l'imaging cardiaco, dopo aver allineato il sistema e determinato i parametri ottimali per la sincronizzazione del sistema, procedere con i passaggi da 2.6 a 2.9.
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Representative Results
È stato dimostrato che LSM favorisce gli studi cardiaci 31,32,33,34,35,36,37 a causa del rischio minimo di danni fotografici, dell'elevata risoluzione spaziale e del sezionamento ottico rispetto ad altri metodi di imaging ottico come le tecniche di scansione in campo chiaro e a punti 6,8,38,39,40 . Pertanto, per comprendere meglio l'architettura miocardica 3D, abbiamo stabilito il protocollo basato su approcci primari tra cui la cancellazione iDISCO adattata, lo stitching delle immagini, la deconvoluzione multiview e l'ASLM. Sebbene abbiamo presentato i risultati utilizzando modelli murini, è importante notare che anche i ratti e altri modelli di roditori sono adatti ai metodi proposti. Il protocollo di pulizia dei tessuti adattato consente di rendere trasparente il cuore di topo P1 entro 4 giorni e il cuore di topo di 8 settimane trasparente entro 7 giorni (Figura 1B). Questo passaggio serve come punto di partenza per ridurre al minimo l'assorbimento e la dispersione dei fotoni nel cuore intatto. La deconvoluzione multivista consente di migliorare la risoluzione assiale fondendo le immagini da più prospettive in un unico modello. Dopo aver registrato in sequenza immagini da 6 viste dello stesso cuore, il metodo di deconvoluzione multivista raggiunge una risoluzione quasi isotropa con un laterale di 4,68 μm e assiale di 5,06 μm, dopo 15 ore di calcolo (Figura 8A). Per ovviare alla complessità computazionale, abbiamo ulteriormente personalizzato un ASLM basato su ETL per l'immagine da cuori di topo neonatale a adulto. Questo metodo ci consente di scansionare il miocardio con un raggio laser strettamente focalizzato, riducendo al minimo lo sfondo sfocato e migliorando il contrasto dell'immagine rispetto ai metodi LSM convenzionali (Figura 8B). Con l'attuale design ASLM, le risoluzioni laterali e assiali medie del sistema raggiungono rispettivamente 2,18 μm e 2,88 μm, consentendo un'esplorazione approfondita della trabecolazione miocardica nei ventricoli. Inoltre, lo stitching delle immagini può essere utilizzato in modo indipendente o in combinazione con la deconvoluzione multiview o ASLM per espandere il FOV per campioni di dimensioni maggiori. L'integrazione dello stitching con ASLM ci consente di coprire l'intero cuore di topo di 8 settimane con una risoluzione uniforme (Figura 8C), fornendo una soluzione efficace per studiare la sezione trasversale dell'intero cuore.
Figura 1: Processo di schiarimento dei tessuti. (A) Il metodo idrofobico prevede la disidratazione dei tessuti, l'estrazione dei lipidi e la corrispondenza dell'indice di rifrazione utilizzando l'etere dibenzilico (DBE) come solvente organico. (B) Immergere il cuore in una miscela di soluzione di formaldeide al 4% (PFA) e disidratarlo con un gradiente di miscele di metanolo e acqua deionizzata (DI). Sbiancare il cuore utilizzando il 5% di H2O2 in metanolo a 4 °C. Delipidate il cuore con diclorometano (DCM) e soluzione di metanolo fino a quando il campione non affonda sul fondo della provetta. Infine, incubare il cuore in DBE per ottenere l'indice di rifrazione desiderato. Linee della griglia 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema della microscopia a foglio di luce a scansione assiale. (A) Camera stampata in 3D personalizzata, (B) magnete della camera, (C) supporto del morsetto e (D) sistema ASLM. Abbreviazioni: CL: lente cilindrica; ETL: lente sintonizzabile elettronica; IL: lente di illuminazione; DL: lente di rilevamento; FW: ruota portafiltri; TL: lente tubolare. Questa cifra è stata modificata da Ref16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Unione delle immagini e deconvoluzione multivista. (A-B) La cucitura delle immagini viene utilizzata per coprire gli interi cuori del mouse, con ogni riquadro che ha una sovrapposizione FOV del 10% con le piastrelle adiacenti. (C) Modello di movimento del cuore del mouse per lo stitching delle immagini. (D) Le perle fluorescenti sono fissate all'estremità del tubo di vetro per facilitare la registrazione dell'immagine, mentre il cuore è posizionato all'interno del tubo di vetro contenente DBE, consentendo l'imaging simultaneo sia del cuore del topo che delle perle fluorescenti. (E) La deconvoluzione multivista comporta l'acquisizione di immagini da sei prospettive distinte, ognuna delle quali raccoglie immagini da direzioni uniche. (F) Dati grezzi del cuore e delle perline del topo P1 a diversi angoli di 0°, 60°, 120°, 180°, 240° e 300°. Barre di scala: 500 μm. Questa cifra è stata modificata da16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Schema a blocchi del sistema ASLM. Utilizzo della scheda DAQ per la sincronizzazione di ETL e fotocamera sCMOS. L'alloggiamento del driver ETL è stato aperto per la saldatura dei cavi di segnale e di terra al PCB. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Pannello di controllo LabView. Pannello di controllo LabVIEW per la generazione di trigger per la sincronizzazione di ETL e pixel attivati della telecamera sCMOS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Sincronizzazione del fuoco del foglio luminoso con i pixel attivati. (A) L'identificazione dei punti iniziale e finale del campo di scansione del foglio luminoso si ottiene configurando la tensione appropriata per il trigger ETL. (B) Il risultato sincrono delle perle fluorescenti è evidente lungo la diagonale dell'immagine. (C-F) La risoluzione spaziale non uniforme sull'intero FOV deriva dal funzionamento asincrono dell'ETL con la fotocamera sCMOS. L'ETL avvia la scansione (C) più tardi o (D) prima del pixel attivato. (E-F) L'area focale non è parallela alla diagonale dell'immagine, indicando un'incompatibilità tra la velocità di scansione e di attivazione. La scansione ETL (E) è più veloce o (F) più lenta rispetto allo sweep dei pixel attivi in sCMOS. Barra della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Risoluzione dei problemi di ASLM. (A) Il foglio luminoso è posizionato esattamente alla distanza focale della lente di rilevamento. L'ETL scansiona il fuoco del foglio luminoso lungo la direzione di propagazione sincronizzandosi con il pixel attivato del sensore sCMOS. (B) Vista XY di sfere fluorescenti quando l'ETL è correttamente allineato e sincronizzato. (C-D) Risultati di microsfere fluorescenti sul piano focale e sfocate nelle immagini in sezione trasversale, che indicano il disallineamento tra la scansione ETL e la propagazione laser. Barre di scala: 200 μm e 10 μm nell'inserto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Imaging a foglio luminoso di cuori di topo. (A) Immagine con rendering volumetrico del cuore di topo P1 con deconvoluzione multivista che evidenzia la trabecolazione all'interno della cavità ventricolare. (B) Immagini in sezione trasversale del cuore di topo di 8 settimane generate da LSM convenzionale (a sinistra) e ASLM (a destra). Le immagini vengono presentate come dati grezzi. (C) Combinazione di cucitura dell'immagine e ASLM per l'imaging di un cuore di topo di 8 settimane, composto da 12 tessere disposte in 3 tessere orizzontalmente e 4 tessere verticalmente. Barra di scala: 500 μm. Abbreviazioni: LV: ventricolo sinistro, LA: atrio sinistro, RV: ventricolo destro e RA: atrio destro. Questa cifra è stata modificata da Ref16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Procedimento | Tempo (P1 cuore di topo) | Tempo (cuore di topo di 8 settimane) | Temperatura | |||
| Correzione in PFA al 4% | Per la notte | Per la notte | 4°C | Preparazione del campione | ||
| Lavare con 1x PBS | 30 minuti | 30 minuti | RT | |||
| Lavare con 1x PBS | 30 minuti | 30 minuti | RT | |||
| Lavare con 1x PBS | 30 minuti | 30 minuti | RT | |||
| Incorporare con gel di agarosio | 1 ora | 2 h | RT | |||
| Incubare in 20% metanolo/80% acqua deionizzata | 1 ora | 2 h | RT | Disidratazione | ||
| Incubare in acqua al 40% metanolo/60% DI | 1 ora | 2 h | RT | |||
| Incubare in acqua al 60% metanolo/40% deionizzata | 1 ora | 2 h | RT | |||
| Incubare in 80% metanolo/20% acqua deionizzata | 1 ora | 2 h | RT | |||
| Incubare in metanolo al 100% | 1 ora | 2 h | RT | |||
| Incubare in metanolo fresco al 100% | 1 ora | 2 h | RT | |||
| Incubare in metanolo fresco al 100% | 10 minuti | 10 minuti | 4°C | Depigmentazione | ||
| Candeggina con 5% di H2O2/metanolo | Per la notte | Per la notte | 4°C | |||
| Incubare in metanolo al 100% | 1 ora | 1 ora | RT | |||
| Delipidato con 66% DCM/33% metanolo sull'agitatore | 3 h | 3 h | RT | Rilassamento | ||
| Incubare in DBE sull'agitatore | 2 giorni | 5 giorni | RT | Corrispondenza RI | ||
Tabella 1: Passaggi personalizzati per la pulizia dei tessuti per l'imaging in autofluorescenza.
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Discussion
Il progresso dei metodi di imaging, calcolo e pulizia dei tessuti ha fornito un'opportunità senza precedenti per studiare ampiamente la struttura e la funzione cardiaca. Ciò ha un grande potenziale per approfondire la nostra comprensione della morfogenesi e della patogenesi cardiaca utilizzando un modello di cuore di roditore intatto. A differenza degli studi in vivo sul cuore del pesce zebra che utilizzano un approccio simile 40,41,42,43, l'integrazione di tecniche LSM avanzate e metodi di pulizia dei tessuti ci consente di superare le sfide tra risoluzione spaziale e profondità di penetrazione durante l'imaging del modello di roditore 9,44. Le tecniche di pulizia dei tessuti rendono i cuori otticamente trasparenti rimuovendo i lipidi e altri elementi di diffusione della luce, consentendo una penetrazione più profondadell'imaging 45. Se accoppiato con LSM, siamo in grado di visualizzare il miocardio. Questa combinazione migliora la profondità dell'imaging e consente l'osservazione di un'intricata microstruttura miocardica. Sebbene siano stati stabiliti numerosi metodi di clearing18, abbiamo adattato iDISCO20 per rendere rapidamente trasparente il cuore intatto rispetto ad altri metodi di clearing dei tessuti15, rendendolo prontamente disponibile per l'imaging dell'autofluorescenza dal miocardio. Per la marcatura specifica della fluorescenza, i protocolli originali iDISCO e Adipo-Clear46 possono essere combinati con l'immunocolorazione in questo sistema di imaging personalizzato, nonostante l'incubazione più lunga. Nel frattempo, per lo studio proposto sono preferiti metodi che preservano la fluorescenza endogena e richiedono tempi di elaborazione più brevi. A differenza di altri metodi, questa piattaforma offre i seguenti vantaggi. In primo luogo, utilizziamo un protocollo iDISCO adattato per la pulizia dei tessuti, consentendo una rapida resa trasparente del cuore in meno di 1 settimana mantenendo l'autofluorescenza del miocardio. In secondo luogo, incorporiamo metodi computazionali come lo stitching delle immagini e la deconvoluzione multivista in questo sistema di fogli luminosi consolidato per l'imaging cardiaco. Infine, progettiamo e sincronizziamo il sistema ASLM per migliorare la risoluzione assiale su un ampio FOV, consentendo l'imaging multiscala e l'analisi della compattazione e della trabecolazione del miocardio a una risoluzione quasi isotropa.
Per acquisire immagini cardiache del modello di roditore, abbiamo fornito quattro approcci basati su LSM: i) il metodo convenzionale per scopi di screening19, ii) lo stitching delle immagini, iii) la deconvoluzione multiview e iv) la scansione ASLM. Considerando la variazione delle dimensioni del cuore tra i diversi modelli, abbiamo cercato di affrontare il compromesso fondamentale in termini di risoluzione spaziale, velocità di acquisizione e FOV. Mentre lo stitching delle immagini consente l'ampio FOV con una risoluzione spaziale compromessa, la combinazione con la deconvoluzione multiview o ASLM fornisce una risoluzione quasi isotropa attraverso il FOV esteso per coprire l'intero cuore del topo adulto. Inoltre, l'integrazione di questi metodi migliora la qualità dell'immagine e il contrasto nel tessuto profondo, consentendo una ricostruzione digitale completa di modelli 3D di microstrutture come la trabecolazione miocardica e la compattazione all'interno dei ventricoli. Tuttavia, il diluvio di set di dati, gli elevati costi di elaborazione computazionale, la necessità di una registrazione precisa delle immagini e il potenziale di artefatti nella deconvoluzione multivista e nello stitching delle immagini ostacolano le loro ampie applicazioni. Sebbene l'ASLM sia un'alternativa emergente, la complessità della sincronizzazione del sistema, le strategie di scansione laser e la dipendenza dalla trasparenza dei tessuti pongono sfide che possono influire sulla robustezza del sistema e aumentare il rischio di danni fotografici al cuore.
Collettivamente, questa metodologia, che include l'imaging LSM e la pulizia dei tessuti, fornisce un punto di partenza per esplorare la struttura cardiaca dai neonati agli adulti. Ha il potenziale per localizzare la distribuzione di linee cardiache specializzate e le loro funzioni durante lo sviluppo cardiaco47. Con lo sviluppo dell'analisi computazionale su misura per applicazioni cardiache 6,48,49,50,51,52,53 , questo quadro può essere esteso per studiare i processi di rimodellamento cardiaco, in particolare in risposta all'infarto del miocardio. In definitiva, questa strategia olistica ha il potenziale per svelare il meccanismo alla base della morfogenesi cardiaca e far progredire lo sviluppo di interventi terapeutici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Esprimiamo la nostra gratitudine al gruppo del Dr. Eric Olson presso l'UT Southwestern Medical Center per aver generosamente condiviso i modelli animali. Apprezziamo tutti i commenti costruttivi forniti dai membri dell'incubatore D presso UT Dallas. Questo lavoro è stato supportato dal programma NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) e UT Dallas STARS (YD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 - 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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