使用CyDye DIGE Fluor公司最小染料的细胞表面蛋白的选择性标签
Summary
一个简单的和具体的方法是没有分馏步骤细胞表面蛋白的荧光标记和增强检测证明。差分在细胞表面的蛋白质丰度使用的二维（2 – D）电泳和Ettan™DIGE技术进行了分析。
Abstract
表面蛋白是细胞的反应能力，它的环境，与邻近的细胞相互作用的核心。它们是已知的几乎所有的细胞内信号诱导。此外，他们在环境适应和药物治疗发挥重要作用，而且往往在疾病的发病机制和病理（1）参与。蛋白质 – 蛋白质相互作用的内在信号通路，并获得更深入地了解这些复杂的生物过程，需要敏感和可靠的方法是研究细胞表面的蛋白质。二维电泳（2 – D）是广泛用于复杂的蛋白质样品中的生物标志物和其他目标的检测，研究差的变化。细胞表面蛋白，部分原因是由于他们的低丰度（1 2％的细胞蛋白），是很难检测到，没有分馏或一些其他类型的浓缩在一个2 – D凝胶。他们也往往不佳的2 – D凝胶，由于其疏水性和超高分子量（2）表示。在这项研究中，我们提出一个新的协议为使用这种蛋白质的重要的一组特定的标签和检测CyDye DIGE Fluor公司最小的染料的完整细胞。结果表明：大量的细胞表面蛋白与细胞内蛋白质的最小标签的具体标注。此协议是快速，简单易用，所有三个CyDye DIGE Fluor公司（赛扬2，赛扬3和CY 5）最小的染料，可用于标记细胞表面蛋白。这些特性允许复用的2 – D荧光差异凝胶电泳（2 – D DIGE）Ettan DIGE技术和使用DeCyder的2 – D差异分析软件蛋白表达变化的分析。随后在CHO细胞中不同的时间长度（见表1）血清饥饿的细胞表面蛋白的水平。丰富的小变化，具有精度高，检测结果是由定义的统计方法的支持。
Protocol
细胞培养种植中国仓鼠卵巢细胞（CHO – K1）使用标准细胞培养过程中的F – 12火腿中含10％小牛血清，50 U / ml青霉素，50μg/ ml的硫酸链霉素（Invitrogen公司）与GlutaMAX我。 交易所培养基，无血清培养基。标签的细胞表面蛋白CyDye DIGE Fluor公司Cy3标记或Cy5最小的染料（见部分细胞表面标记 ，下面）在不同的时间点。 从各时间点和CyDye DIGE Fluor公司CY2标签细胞的数目相等的池。使…
Discussion
蛋白质浓度
概述两个标签工作流程如图1所示。根据细胞表面蛋白标签协议标记时，由于细胞仍然完好，只在细胞表面的蛋白质暴露的染料。在标准Ettan DIGE协议，细胞裂解之前，标签和内以及在细胞外的蛋白质标记（图1）。染料相对量的蛋白质在细胞表面的蛋白标记协议是不知道，因为细胞表面蛋白无法具体定量分析。然而，它是已知的细胞表面蛋白2细胞蛋白构成的?…
Acknowledgements
我们感谢他们的合作，奥地利维也纳大学临床病理研究所教授Dontscho Kerjaschki，科里纳Mayrhofer和Sigurd克里格。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Altro | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Altro | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
Riferimenti
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- . Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- . DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- . 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- . CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- . Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
Tags
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Citazione di questo articolo
Hagner-McWhirter, A., Winkvist, M., Bourin, S., Marouga, R. Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes. J. Vis. Exp. (21), e945, doi:10.3791/945 (2008).