Etichettatura selettiva di proteine ​​della superficie cellulare utilizzando CyDye DIGE Coloranti Fluor Minimal

Summary

Un metodo semplice e specifico è stato dimostrato per la marcatura fluorescente e la rilevazione maggiore di proteine ​​di superficie cellulare, senza un passo di frazionamento. Abbondanza differenziale di proteine ​​della superficie cellulare è stato analizzato mediante elettroforesi bidimensionale (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.

Abstract

Proteine ​​di superficie sono fondamentali per la capacità della cellula di reagire al suo ambiente e di interagire con le cellule vicine. Essi sono noti per essere induttori di quasi tutti i segnali intracellulari. Inoltre, essi svolgono un ruolo importante nell'adattamento ambientale e trattamento farmacologico, e spesso sono coinvolti nella patogenesi della malattia e patologia (1). Interazioni proteina-proteina sono intrinseche vie di segnalazione, e per ottenere un quadro più chiaro in questi complessi processi biologici, metodi sensibili e affidabili sono necessari per lo studio delle proteine ​​di superficie delle cellule. Bidimensionale (2-D) elettroforesi è ampiamente utilizzato per il rilevamento dei biomarcatori e altri obiettivi in ​​campioni di proteine ​​complesse per studiare i cambiamenti differenziale. Proteine ​​di superficie cellulare, in parte a causa della loro abbondanza basso (1 2% di proteine ​​cellulari), sono difficili da individuare in un 2-D gel senza frazionamento o qualche altro tipo di arricchimento. Sono anche spesso poco rappresentati in 2-D gel a causa della loro natura idrofobica e ad alto peso molecolare (2). In questo studio, presentiamo un nuovo protocollo per le cellule intatte mediante CyDye DIGE coloranti Fluor minimi specifici per l'etichettatura e la rilevazione di questo importante gruppo di proteine. I risultati hanno mostrato specifici dell'etichettatura di un gran numero di proteine ​​di superficie delle cellule con l'etichettatura minimo di proteine ​​intracellulari. Questo protocollo è rapido, semplice da usare, e tutti CyDye tre DIGE coloranti Fluor minima (Cy 2, 3 e Cy Cy 5) può essere usato per etichettare superficie cellulare delle proteine. Queste caratteristiche consentono di multiplexing utilizzando il 2-D elettroforesi su gel a fluorescenza Differenza (2-D DIGE) con tecnologia DIGE Ettan e l'analisi dei cambiamenti dell'espressione proteica con DeCyder 2-D Software differenziale di analisi. Il livello di superficie cellulare delle proteine ​​è stato seguito durante il digiuno nel siero di cellule CHO per varie lunghezze di tempo (vedi tabella 1). Piccoli cambiamenti in abbondanza sono stati rilevati con elevata precisione, ed i risultati sono supportati da definire metodi statistici.

Protocol

Coltura cellulare Crescere le cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) utilizzando le procedure standard di coltura cellulare in F-12 di media Ham con GlutaMAX ho contenente il 10% di siero fetale bovino, 50 U / ml di penicillina, e 50 mg / ml di streptomicina solfato (Invitrogen). Scambio terreno di coltura di siero di supporti liberi. Etichetta proteine ​​di superficie della cellula erano in diversi momenti con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 coloranti minima (vedi cellulare Etichettatura</e…

Discussion

Concentrazione di proteine

Una panoramica dei due flussi di lavoro di etichettatura è illustrato nella figura 1. Dal momento che le cellule sono ancora intatte quando etichettati secondo la superficie cellulare protocollo proteina etichettatura, solo le proteine ​​della superficie cellulare sono esposti al colorante. Nello standard Ettan DIGE protocollo, le cellule sono lisate prima di etichettatura e di proteine ​​all'interno e all'esterno della cellula sono etichettati (Fig….

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Heallthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Altro	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Altro	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122