Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.
Proteínas de superficie son esenciales para la capacidad de las células para reaccionar a su entorno e interactuar con las células vecinas. Son conocidos por ser inductores de casi toda la señalización intracelular. Además, juegan un papel importante en la adaptación del medio ambiente y tratamiento de drogas, y están a menudo involucrados en la patogénesis de la enfermedad y la patología (1). Interacciones proteína-proteína son intrínsecos a las vías de señalización, y para obtener mayor conocimiento en estos procesos biológicos complejos, los métodos sensibles y fiables son necesarios para el estudio de las proteínas de la superficie celular. De dos dimensiones (2-D) de electroforesis es ampliamente utilizado para la detección de biomarcadores y otras metas, en las muestras de proteínas complejas para estudiar los cambios diferenciales. Proteínas de superficie celular, en parte debido a su baja abundancia (un 2% de las proteínas celulares), son difíciles de detectar en un gel 2-D sin fraccionamiento o algún otro tipo de enriquecimiento. También están a menudo mal representados en geles 2-D, debido a su naturaleza hidrofóbica y de alto peso molecular (2). En este estudio, se presenta un nuevo protocolo para las células intactas utilizando CyDye DIGE tintes Fluor mínimos para el etiquetado específico y la detección de este importante grupo de proteínas. Los resultados mostraron un etiquetado específico para un gran número de proteínas de superficie celular con un mínimo de etiquetado de las proteínas intracelulares. Este protocolo es rápido, fácil de usar, y los tres CyDye DIGE tintes Fluor mínima (Cy 2, 3 y Cy Cy 5) puede ser utilizada para etiquetar las proteínas de la superficie celular. Estas funciones permiten la multiplexación mediante la electroforesis en 2-D de fluorescencia Gel Diferencia (2-D DIGE) con Ettan tecnología DIGE y el análisis de los cambios de expresión de la proteína usando DeCyder 2-D software de análisis diferencial. El nivel de las proteínas de la superficie celular se siguió durante la privación de suero de las células CHO durante distintos períodos de tiempo (ver Tabla 1). Los pequeños cambios en la abundancia se detectaron con gran precisión, y los resultados se definen con el apoyo de métodos estadísticos.
Concentración de proteínas
Una visión general de los dos flujos de trabajo de etiquetado se muestra en la Figura 1. Dado que las células están intactas cuando una etiqueta según el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado, sólo las proteínas de superficie de las células son expuestas a la tintura. En el protocolo estándar Ettan DIGE, las células se lisan antes de su etiquetado y las proteínas dentro como fuera de la célula están etiquetados (Fig. 1). La ca…
Agradecemos al profesor Dontscho Kerjaschki, Mayrhofer Corina y Krieger Sigurd en el Instituto de Patología Clínica de la Universidad de Viena, Austria, por su colaboración.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Altro | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
ImageQuant Analysis Software | Altro | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |