Селективный маркировки на поверхности клеток белков, используя CyDye ПГЛП Fluor Минимальная Красители

Summary

Простой и конкретный метод был продемонстрирован для флуоресцентной маркировки и усовершенствованные функции обнаружения белков клеточной поверхности, без фракционирования шаг. Дифференциальная обилие белков клеточной поверхности, были проанализированы с использованием двумерных (2-D), электрофорез и Ettan ™ ПГЛП технологии.

Abstract

Поверхностные белки играют центральную роль в способности клеток к реагируют на окружающую среду и взаимодействие с соседними клетками. Они, как известно, индукторы практически всех внутриклеточных сигнальных. Более того, они играют важную роль в экологической адаптации и лечения наркозависимости, и часто участвует в патогенезе заболевания и патологии (1). Белок-белковые взаимодействия присущи сигнальных путей, а также получить более глубокое в этих сложных биологических процессов, чувствительных и надежных методов, необходимых для изучения белков клеточной поверхности. Двумерные (2-D) электрофореза широко используется для обнаружения биомаркеров и другие цели в сложных образцов белков изучать дифференциальные изменения. Сотовые поверхностных белков, частично из-за их низкой численности (1 2% клеточных белков), которые трудно обнаружить в 2-D гель без фракционирования или какой-либо другой тип обогащения. Они также часто слабо представлены в 2-D гелями из-за их гидрофобной природы и высокой молекулярной массой (2). В этом исследовании мы представляем новый протокол для нетронутыми клетки, используя CyDye ПГЛП Fluor минимальным красители для конкретной маркировки и обнаружения этой важной группы белков. Результаты показали, конкретных маркировки большого количества белков клеточной поверхности с минимальной маркировки внутриклеточных белков. Этот протокол является быстрым, простым в использовании, и все три CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителей (Су 2, 3 и Су Су 5) может быть использован для обозначения на поверхности клеток белков. Эти функции позволяют мультиплексирования использованием 2-D флуоресцентный гель-электрофореза Разница (2-D ПГЛП) с Ettan ПГЛП технологии и анализ экспрессии белка изменения с помощью DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения. Уровень поверхности клеток белков последовало во время сыворотке голодание клеток СНО для различных периодов времени (см. Таблицу 1). Небольшие изменения в изобилии были обнаружены с высокой точностью, и результаты поддерживаются определены статистические методы.

Protocol

Клеточные культуры Рост китайского хомячка яичников клеток (СНО-К1) с использованием стандартных процедур культур клеток, в F-12 Хэм среде с GlutaMAX Я, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина сульфат (Invitrogen). Биржа питательной с…

Discussion

Концентрация белка

Обзор двух рабочих процессов маркировки показан на рисунке 1. Поскольку клетки остаются нетронутыми, когда маркированный в соответствии со клеточной поверхности протокол маркировки белка, только белки клеточной поверхности, подвержены красителя. В с…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Heallthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Altro	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Altro	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122