Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires
Summary
Cette procédure utilise une lumière bleue-activé le canal d'algues et de cellules d'outils spécifiques d'expression génétique pour évoquer les potentiels synaptiques avec des impulsions de lumière à la jonction neuromusculaire (JNM) dans<em> Drosophile</emLarves>. Cette technique est un moyen peu coûteux et facile à utiliser, alternative à la stimulation d'électrodes d'aspiration pour les études de physiologie synaptique dans la recherche et des laboratoires d'enseignement.
Abstract
L'<em> Drosophile</em> Larvaires neuromusculaires préparation s'est avérée être un outil utile pour étudier la physiologie synaptique<sup> 1,2,3</sup>. Actuellement, le seul moyen disponible pour évoquer les potentiels excitateurs jonctionnelle (EJPs) dans cette préparation implique l'utilisation d'électrodes d'aspiration. Dans les deux laboratoires de recherche et d'enseignement, les étudiants ont souvent des difficultés à manœuvrer et manipuler ce type d'électrode de stimulation. Dans le présent travail, nous montrons comment stimuler la distance potentiels synaptiques à la JNM larvaires sans l'utilisation d'électrodes d'aspiration. En exprimant channelrhodopsin2 (CHR2)<sup> 4,5,6</sup> Dans<em> Drosophile</em> Neurones moteurs en utilisant les<em> GAL4 UAS-</em> Système<sup> 7</sup>, Et en faisant des changements mineurs à une plate-forme de base électrophysiologie, nous avons pu évoquer de manière fiable EJPs avec des impulsions de lumière bleue. Cette technique pourrait être particulièrement utile dans les laboratoires d'enseignement de neurophysiologie, où le temps la pratique des étudiants gréement et les ressources sont limitées.
Protocol
Discussion
Les étapes critiques impliquent à la fois la dissection initiale et l'entrée des cellules musculaires. Si les nerfs sont coupés ou muscle est endommagé lors de la dissection initiale, il est difficile de continuer le reste de l'expérience. Pendant la dissection, il faut être très prudent à l'angle de disséquer des ciseaux à la hausse autant que possible lors de l'incision dorsale. Durant la deuxième étape cruciale, entrer dans une cellule musculaire, il faut regarder pour un hyperpolarisatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions de la santé RO1GM-33205 et MH-067284 à LC Griffith et par une bourse de Brandeis Université d'été de recherche de premier cycle à NJ Hornstein. Des expériences préliminaires de cette technique ont été réalisées au Laboratoire de biologie marine dans le cadre de l'édition 2008 des systèmes neuronaux et cours d'été de comportement (NIMH subvention: R25 MH059472) à Woods Hole, MA.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| Sylgard | Ellsworth adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com | |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com | |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | ||
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com | |
| Powerlab 4/30 data acquisition system | AD instruments | www.adinstruments.com | ||
| Grass stimulator | Grass instruments | www.grasstechnologies.com | ||
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | ||
| Dissecting Scope | Leica | www.leica-microsystems.com | ||
| Light Source | Dolan-Jenner | 41446-062 | www.dolan-jenner.com | |
| Fly Media | ||||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com | |
| OK-371 Gal4 Flies | Aberle lab, Griffith lab, Bloomington stock center | |||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | |||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
||
| LED Heat Sink | Thor Labs | http://www.thorlabs.com/ | ||
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | ||
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | |||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Leitz | ACS01 | www.leica-microsystems.com | |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | ||
| Borosilicate Glass | FHC | www.fh-co.com/p14-15.pdf | ||
| Electrode Puller | Sutter Instruments | www.sutter.com | ||
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
|||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
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- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
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- Ralph Greenspan, . . Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , (2004).
