Channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en Drosophila Las uniones neuromusculares
Summary
Este procedimiento utiliza una luz azul activa el canal de las algas y las células específicas de las herramientas de la expresión genética para evocar los potenciales sinápticos con pulsos de luz en la unión neuromuscular (UNM), en<em> Drosophila</em> Larvas. Esta técnica es un barato y fácil de usar alternativas a la estimulación de electrodos de aspiración para los estudios de la fisiología sináptica en laboratorios de investigación y enseñanza.
Abstract
La<em> Drosophila</em> Larvas preparación neuromuscular ha demostrado ser una herramienta útil para el estudio de la fisiología sináptica<sup> 1,2,3</sup>. En la actualidad, el único medio disponible para evocar potenciales excitatorios de la unión (EJPs) en esta preparación implica el uso de electrodos de succión. En los dos laboratorios de investigación y enseñanza, los estudiantes suelen tener dificultades para maniobrar y manipular este tipo de electrodo de estimulación. En el presente trabajo, se muestra la forma de estimular de forma remota los potenciales sinápticos en el larval NMJ sin el uso de electrodos de succión. Al expresar channelrhodopsin2 (ChR2)<sup> 4,5,6</sup> En<em> Drosophila</em> Neuronas motoras con el<em> GAL4-UAS</em> Sistema de<sup> 7</sup>, Y hacer cambios menores a un equipo de electrofisiología básica, hemos sido capaces de evocar de forma fiable EJPs con pulsos de luz azul. Esta técnica podría ser de particular utilidad en los laboratorios de neurofisiología en la enseñanza plataforma estudiante de tiempo la práctica y los recursos son limitados.
Protocol
Discussion
Los pasos críticos incluyen tanto la disección inicial y la entrada de las células musculares. Si los nervios se cortan o músculo dañado durante la disección inicial es difícil continuar con el resto del experimento. Durante la disección, se debe tener mucho cuidado con el ángulo de la disección de las tijeras hacia arriba tanto como sea posible durante la incisión dorsal. Durante el paso crucial en segundo lugar, entrar en una célula muscular, se debe vigilar a una hiperpolarización últimos ~ 30 mV. Valor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones RO1GM MH-33205 y 067284-LC a Griffith y por una beca de la Universidad de Brandeis de investigación de verano para universitarios NJ Hornstein. Los experimentos preliminares de esta técnica se realizaron en el Laboratorio de Biología Marina, como parte de los 2.008 sistemas neurales y por supuesto el comportamiento de verano (NIMH subvención: R25 MH059472) en Woods Hole, MA.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| Sylgard | Ellsworth adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com | |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com | |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | ||
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com | |
| Powerlab 4/30 data acquisition system | AD instruments | www.adinstruments.com | ||
| Grass stimulator | Grass instruments | www.grasstechnologies.com | ||
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | ||
| Dissecting Scope | Leica | www.leica-microsystems.com | ||
| Light Source | Dolan-Jenner | 41446-062 | www.dolan-jenner.com | |
| Fly Media | ||||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com | |
| OK-371 Gal4 Flies | Aberle lab, Griffith lab, Bloomington stock center | |||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | |||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
||
| LED Heat Sink | Thor Labs | http://www.thorlabs.com/ | ||
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | ||
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | |||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Leitz | ACS01 | www.leica-microsystems.com | |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | ||
| Borosilicate Glass | FHC | www.fh-co.com/p14-15.pdf | ||
| Electrode Puller | Sutter Instruments | www.sutter.com | ||
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
|||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
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