Channelrhodopsin2 опосредованная стимуляция синаптические потенциалы в Drosophila Нервно-мышечная переходов
Summary
Эта процедура использует синий свет активированных водорослей канала и клеточно-специфических генетических инструментов выражение, чтобы вызвать синаптических потенциалов с световые импульсы в нервно-мышечном соединении (NMJ) в<em> Drosophila</em> Личинок. Эта технология представляет собой недорогой и простой в использовании альтернатива всасывания электрода стимуляции синаптических исследования физиологии в научные исследования и учебные лаборатории.
Abstract
<em> Drosophila</em> Личиночной нервно-мышечной подготовки оказался полезным инструментом для изучения физиологии синаптической<sup> 1,2,3</sup>. В настоящее время единственным доступным средством, чтобы вызвать возбуждающее соединительного потенциалов (EJPs) в этой подготовки включает в себя использование всасывания электродов. В обоих исследованиях и преподавании лабораториях, студенты часто испытывают трудности маневрирования и манипулирования этим типом стимулирующий электрод. В настоящей работе мы покажем, как удаленно стимулировать синаптических потенциалов на личиночной NMJ без использования всасывающих электродов. Выражая channelrhodopsin2 (ChR2)<sup> 4,5,6</sup> В<em> Drosophila</em> Моторных нейронов использованием<em> GAL4-UAS</em> Системы<sup> 7</sup>, И делая незначительные изменения в основные установки электрофизиологии, мы были в состоянии надежно вызывают EJPs с импульсами голубого света. Эта техника может быть особенно полезной в нейрофизиологии обучения лаборатории, где студент установки время практики и ресурсы ограничены.
Protocol
Discussion
Критические шаги включают в себя как начальное вскрытие и внесение мышечные клетки. Если нервы вырезать или мышца повреждена во время начальной вскрытия трудно продолжать остальной эксперимента. Во время вскрытия, нужно быть очень осторожным, чтобы угол рассекает ножницы вверх как мо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья гранты RO1GM-33205 и MH-067284 для LC Гриффит и летом Brandeis University студентов стипендию исследований Нью-Джерси Hornstein. Предварительные эксперименты для этой техники были выполнены в Морской биологической лаборатории в составе 2008 нейронные системы и поведение летний курс (NIMH гранта: R25 MH059472) в Вудс-Хол, Массачусетс.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| Sylgard | Ellsworth adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com | |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com | |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | ||
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com | |
| Powerlab 4/30 data acquisition system | AD instruments | www.adinstruments.com | ||
| Grass stimulator | Grass instruments | www.grasstechnologies.com | ||
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | ||
| Dissecting Scope | Leica | www.leica-microsystems.com | ||
| Light Source | Dolan-Jenner | 41446-062 | www.dolan-jenner.com | |
| Fly Media | ||||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com | |
| OK-371 Gal4 Flies | Aberle lab, Griffith lab, Bloomington stock center | |||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | |||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
||
| LED Heat Sink | Thor Labs | http://www.thorlabs.com/ | ||
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | ||
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | |||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Leitz | ACS01 | www.leica-microsystems.com | |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | ||
| Borosilicate Glass | FHC | www.fh-co.com/p14-15.pdf | ||
| Electrode Puller | Sutter Instruments | www.sutter.com | ||
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
|||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, . . Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , (2004).
