Channelrhodopsin2 Estimulação Mediated de Potenciais Synaptic em Drosophila Junções Neuromusculares
Summary
Este procedimento utiliza um canal activado pela luz azul de algas e células específicas de ferramentas de expressão genética para evocar potenciais sinápticos com pulsos de luz na junção neuromuscular (MNJ), em<em> Drosophila</emLarvas>. Esta técnica é um barato e fácil de usar alternativas ao estímulo de sucção do eletrodo para estudos de fisiologia sináptica em pesquisa e laboratórios de ensino.
Abstract
O<em> Drosophila</em> Larval preparação neuromuscular tem provado ser uma ferramenta útil para estudar a fisiologia sináptica<sup> 1,2,3</sup>. Atualmente, o único meio disponível para evocar potenciais excitatórios juncional (EJPs) nesta preparação envolve o uso de eletrodos de sucção. Em ambas as pesquisas e laboratórios de ensino, os alunos muitas vezes têm dificuldade em manobrar e manipular este tipo de eletrodo estimulante. No presente trabalho, mostramos como remotamente estimular potenciais sinápticos no MNJ larval sem o uso de eletrodos de sucção. Expressando channelrhodopsin2 (ChR2)<sup> 4,5,6</sup> Em<em> Drosophila</em> Neurônios motores usando o<em> GAL4-UAS</emSistema><sup> 7</sup>, E fazendo pequenas alterações a uma plataforma de eletrofisiologia básica, fomos capazes de evocar de forma confiável EJPs com pulsos de luz azul. Esta técnica pode ser de uso particular em laboratórios de ensino onde alunos neurofisiologia tempo de prática equipamento e os recursos são limitados.
Protocol
Discussion
Passos críticos envolvem tanto a dissecção inicial e à entrada das células musculares. Se os nervos são cortados ou músculo está danificado durante a dissecção inicial é difícil continuar o resto do experimento. Durante a dissecção, deve-se ter muito cuidado para dissecar ângulo tesoura para cima, tanto quanto possível durante a incisão dorsal. Durante a segunda etapa crucial, entrando em uma célula muscular, deve-se prestar atenção para uma hiperpolarização passado ~ 30 mV. Valores acima de -30 mV…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede RO1GM-33205 e MH-067284 a LC Griffith e por uma bolsa de estudos da Universidade de Verão de pesquisa Brandeis graduação para NJ Hornstein. Experimentos preliminares para esta técnica foram realizados no Laboratório de Biologia Marinha, como parte do 2008 Sistemas Neurais e Comportamento curso de verão (NIMH subvenção: R25 MH059472) de Woods Hole, MA.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| Sylgard | Ellsworth adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com | |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com | |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | ||
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com | |
| Powerlab 4/30 data acquisition system | AD instruments | www.adinstruments.com | ||
| Grass stimulator | Grass instruments | www.grasstechnologies.com | ||
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | ||
| Dissecting Scope | Leica | www.leica-microsystems.com | ||
| Light Source | Dolan-Jenner | 41446-062 | www.dolan-jenner.com | |
| Fly Media | ||||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com | |
| OK-371 Gal4 Flies | Aberle lab, Griffith lab, Bloomington stock center | |||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | |||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
||
| LED Heat Sink | Thor Labs | http://www.thorlabs.com/ | ||
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | ||
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | |||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Leitz | ACS01 | www.leica-microsystems.com | |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | ||
| Borosilicate Glass | FHC | www.fh-co.com/p14-15.pdf | ||
| Electrode Puller | Sutter Instruments | www.sutter.com | ||
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
|||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
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- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
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- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
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- Ralph Greenspan, . . Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , (2004).
