Este procedimento utiliza um canal activado pela luz azul de algas e células específicas de ferramentas de expressão genética para evocar potenciais sinápticos com pulsos de luz na junção neuromuscular (MNJ), em<em> Drosophila</emLarvas>. Esta técnica é um barato e fácil de usar alternativas ao estímulo de sucção do eletrodo para estudos de fisiologia sináptica em pesquisa e laboratórios de ensino.
Abstract
O<em> Drosophila</em> Larval preparação neuromuscular tem provado ser uma ferramenta útil para estudar a fisiologia sináptica<sup> 1,2,3</sup>. Atualmente, o único meio disponível para evocar potenciais excitatórios juncional (EJPs) nesta preparação envolve o uso de eletrodos de sucção. Em ambas as pesquisas e laboratórios de ensino, os alunos muitas vezes têm dificuldade em manobrar e manipular este tipo de eletrodo estimulante. No presente trabalho, mostramos como remotamente estimular potenciais sinápticos no MNJ larval sem o uso de eletrodos de sucção. Expressando channelrhodopsin2 (ChR2)<sup> 4,5,6</sup> Em<em> Drosophila</em> Neurônios motores usando o<em> GAL4-UAS</emSistema><sup> 7</sup>, E fazendo pequenas alterações a uma plataforma de eletrofisiologia básica, fomos capazes de evocar de forma confiável EJPs com pulsos de luz azul. Esta técnica pode ser de uso particular em laboratórios de ensino onde alunos neurofisiologia tempo de prática equipamento e os recursos são limitados.
Protocol
Parte 1: o cuidado de animais e cruzes genética Manter-UAS ChR2 e linhas OK371-GAL4 voar em frascos separados contendo media voar padrão 8. Coletar virgens de linhas OK371-GAL4 e machos de mosca-UAS ChR2 linhas. Coloque os machos e as fêmeas em um frasco contendo media voar padrão misturado com 1 mM all-trans retinal (ATR). ATR alimentos deve ser feita pelo primeiro derretimento media voar regularmente no microondas por 1 minuto ~. Uma vez derretid…
Discussion
Passos críticos envolvem tanto a dissecção inicial e à entrada das células musculares. Se os nervos são cortados ou músculo está danificado durante a dissecção inicial é difícil continuar o resto do experimento. Durante a dissecção, deve-se ter muito cuidado para dissecar ângulo tesoura para cima, tanto quanto possível durante a incisão dorsal. Durante a segunda etapa crucial, entrando em uma célula muscular, deve-se prestar atenção para uma hiperpolarização passado ~ 30 mV. Valores acima de -30 mV…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede RO1GM-33205 e MH-067284 a LC Griffith e por uma bolsa de estudos da Universidade de Verão de pesquisa Brandeis graduação para NJ Hornstein. Experimentos preliminares para esta técnica foram realizados no Laboratório de Biologia Marinha, como parte do 2008 Sistemas Neurais e Comportamento curso de verão (NIMH subvenção: R25 MH059472) de Woods Hole, MA.
Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (25), e1133, doi:10.3791/1133 (2009).