Summary
Мы представляем подробный протокол послевстраивающей коррелятивной световой и электронной микроскопии Epon с использованием флуоресцентного белка mScarlet. Этот метод позволяет поддерживать флуоресценцию и ультраструктуру одновременно. Эта методика поддается широкому спектру биологических применений.
Abstract
Коррелятивная световая и электронная микроскопия (КЛЭМ) — это комплексная микроскопия, которая сочетает в себе информацию о локализации, полученную с помощью флуоресцентной микроскопии (ФМ), и контекст клеточной ультраструктуры, полученной с помощью электронной микроскопии (ЭМ). CLEM — это компромисс между флуоресценцией и ультраструктурой, и обычно ультраструктура нарушает флуоресценцию. По сравнению с другими гидрофильными смолами, такими как глицидилметакрилат, HM20 или K4M, Epon превосходит по свойствам сохранения ультраструктуры и секционирования. Ранее мы продемонстрировали, что mEosEM может выживать при фиксации тетраоксида осмия и встраивании эпона. Используя mEosEM, мы впервые добились поствстраивания Epon CLEM, который поддерживает флуоресценцию и ультраструктуру одновременно. Здесь мы приводим пошаговую информацию о подготовке ЭМ-образца, ФМ-визуализации, ЭМ-визуализации и выравнивании изображения. Мы также усовершенствовали процедуры идентификации одной и той же клетки, визуализированной с помощью ФМ-визуализации, во время ЭМ-визуализации и детализировали регистрацию между ФМ и ЭМ изображениями. Мы полагаем, что с помощью этого нового протокола можно легко получить коррелятивную световую и электронную микроскопию Epon после встраивания в традиционные ЭМ-установки.
Introduction
Флуоресцентная микроскопия (ФМ) может быть использована для определения локализации и распределения белка-мишени. Тем не менее, контекст, который окружает целевой белок, теряется, что имеет решающее значение для тщательного изучения целевого белка. Электронная микроскопия (ЭМ) имеет высочайшее разрешение изображения, предоставляя несколько субклеточных деталей. Тем не менее, у EM отсутствует маркировка мишеней. Благодаря точному слиянию флуоресцентного изображения, полученного с помощью ФМ, с серым изображением, полученным с помощью ЭМ, коррелятивная световая и электронная микроскопия (КЛЭМ) может объединить информацию, полученную этими двумя режимами визуализации 1,2,3,4.
CLEM — это компромисс между флуоресценцией и ультраструктурой1. Из-за ограничений современных флуоресцентных белков и традиционных процедур подготовки образцов для ЭМ, особенно с использованием осминовой кислоты (OsO4) и гидрофобных смол, таких как Epon, ультраструктура всегда нарушает флуоресценцию5. OsO4 является незаменимым реагентом при подготовке образцов для ЭМ, который используется для повышения контрастности ЭМ-изображений. По сравнению с другими смолами для встраивания, Epon превосходит его по сохранению ультраструктуры и свойствам секционирования5. Однако ни один флуоресцентный белок не может удерживать флуоресцентный сигнал после обработки OsO4 и встраивания Epon6. Для преодоления ограничений, накладываемых флуоресцентными белками, был разработан метод предварительного встраивания КЛЕМ, при котором ФМ-визуализация проводится перед подготовкой ЭМ-образца6. Однако недостатком предварительного встраивания CLEM является неточная регистрация между FM и EM изображениями5.
Напротив, метод КЛЭМ после встраивания выполняет ЧМ-визуализацию после подготовки ЭМ образца, точность регистрации которой может достигать 6-7 нм 5,6. Для сохранения флуоресценции флуоресцентных белков использовали очень низкие концентрации OsO4 (0,001%)3 или методы получения ЭМ 4,7 с замораживанием под высоким давлением (HPF) и замораживанием (FS) 4,7 за счет нарушения ультраструктуры или контрастности ЭМ-изображения. Разработка mEos4b в значительной степени способствует прогрессу после встраивания CLEM, хотя в качестве встраивающей смолы используется глицидилметакрилат5. С развитием mEosEM, который может выдерживать окрашивание OsO4 и встраивание Epon, впервые был достигнут CLEM сверхвысокого разрешения после встраивания Epon, сохраняющий флуоресценцию и ультраструктуру одновременно6. После mEosEM было разработано несколько флуоресцентных белков, которые могут пережить окрашиваниеOsO4 и встраивание эпона 8,9,10,11. Это в значительной степени способствует развитию CLEM.
Существует три ключевых аспекта Epon после встраивания CLEM. Во-первых, это флуоресцентный белок, который должен поддерживать флуоресцентный сигнал после подготовки ЭМ-образца. Согласно нашему опыту, mScarlet превосходит другие флуоресцентные белки. Во-вторых, как найти ту же самую клетку, которую визуализирует ФМ-визуализация при ЭМ-визуализации. Чтобы решить эту проблему, мы усовершенствовали процедуру этого шага, чтобы можно было легко найти целевую клетку. Последним является метод выравнивания FM-изображения с электромагнитным изображением. Здесь мы подробно опишем регистрацию между FM и EM изображениями. В этом протоколе мы экспрессируем mScarlet в нейронах VGLUT2 и демонстрируем, что mScarlet может нацеливаться на вторичные лизосомы с помощью Epon после встраивания CLEM. Мы предоставляем пошаговую информацию для Epon после встраивания CLEM без ущерба для флуоресценции и ультраструктуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животноводство и эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Фуцзяньского медицинского университета. Пошаговый рабочий процесс текущего протокола показан на рисунке 1.
1. Пробоподготовка
- Мозг мыши
- Приобретите трансгенных мышей (см. Таблицу материалов) и олигонуклеотидные праймеры (см. Таблицу материалов) для генотипирования этих мышей.
- Перфузия и удаление неповрежденного мозга из свода черепа в соответствии с ранее опубликованным протоколом12,13.
- Зафиксируйте мозг мыши с помощью 10 мл фиксирующего раствора (см. Таблицу материалов) при температуре 4 °C на ночь.
- Смойте фиксирующий раствор в течение 3 x 10 мин 0,1 М фосфатным буфером (PB).
- Разрежьте мозг мыши на участки толщиной 500 мкм с помощью осциллирующего микротома (см. таблицу материалов).
- Разрежьте флуоресцентные участки на небольшие блоки скальпелем с помощью стереомикроскопа (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем мелких блоков не должен превышать 1мм3.
- Культивируемые клетки
- Высевают клетки HeLa в 6-сантиметровые чашки для клеточных культур и выдерживают их в питательной среде (модифицированная среда Eagle medium [DMEM] Dulbecco с низким содержанием глюкозы, дополненная 10% фетальной бычьей сывороткой [FBS]).
- На следующий день трансфицируют плазмиды, содержащие mScarlet, в клетки с помощью реагента для трансфекции ДНК (см. таблицу материалов) в соответствии с инструкцией к набору для трансфекции.
- Через 48 часов после трансфекции трипсинизируют трансфицированные клетки и центрифугируют их для получения клеточных гранул в концентрации 1000 × г. Клеточные гранулы называются блоками образцов.
2. Подготовка образцов ЭМ
- Фиксация
- Зафиксируйте образцы блоков с помощью фиксирующего раствора (см. Таблицу материалов) при температуре 4 °C в течение ночи.
- Удаляют фиксирующий раствор и смывают фиксирующий раствор в течение 3 х 10 мин 0,1 М ПБ из образцовых блоков.
- Окрашивание тетраоксидом осмия (OsO4)
- Блоки образцов закрепляют раствором OsO4 (см. таблицу материалов) при 4 °C в течение 1 ч.
- Удалите раствор OsO4 и смойте раствор OsO4 3 x 10 мин с ddH2O с блоков образцов.
- Окрашивание уранилацетатом (UA)
- Окрасьте образцы блоками 2% раствором UA (см. таблицу материалов) при 4 °C в течение 1 ч.
- Удалите раствор UA и промойте блоки образцов ddH2O в течение 3 x 10 мин.
- Градиентное обезвоживание
- Обезвоживают блоки образца градиентным этанолом следующим образом: 50% в течение 10 мин, 70% в течение 10 мин, 80% в течение 10 мин, 90% в течение 10 мин и 2 x 10 мин в 100% этаноле.
- Обезвоживайте блоки образца безводным ацетоном в течение 3 х 10 мин.
- Инфильтрация смолы
- Пропитайте блоки образца градиентной смолой (см. таблицу материалов): ацетон к смоле 3:1 в течение 1 ч, ацетон к смоле 1:1 в течение 2 ч, ацетон к смоле 1:3 в течение 3 ч.
- Замените чистой смолой на 3 x 12 ч.
- Встраивание смолы
- Переложите блоки образцов в капсулы (см. Таблицу материалов) с помощью зубочистки.
- Добавьте чистую смолу в капсулу, содержащую блок образца, и полимеризуйте смолу в печи при 60 °C в течение 14-16 часов.
3. Покрытие покровного стекла наночастицами золота
- Очистка покровного стекла
- Мойте защитные стекла чистящим буфером (см. Таблицу материалов) в течение 2 ч при температуре 142 °C.
- Смойте чистящий буфер 3 x 10 мин с помощью ddH2O.
- Осторожно переложите покровные стаканы в стакан с безводным этиловым спиртом и инкубируйте в течение ночи.
- Высушите покровные стекла на воздухе на чистом столе в течение нескольких минут.
- Покройте покровные стекла наночастицами золота.
- Закрепите предметное стекло в центре вращения настольной центрифуги (см. Таблицу материалов) с помощью стеклоцемента.
- Закрепите покровное стекло в центре предметного стекла с помощью стикеров.
- Добавьте 75 мкл 1% пиолоформы (см. Таблицу материалов) на покровное стекло.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы также протестировали Formvar (см. Таблицу материалов), и он работает хорошо. - Отжим в течение 3 мин при 1 360 × г (Рисунок 2A), чтобы получить тонкий слой пиолоформы на поверхности покровного стекла.
- Инкубируют поверхность покровного стекла с 250 мкл 0,1% поли-L-лизина (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре (Рисунок 2B).
- Смойте ddH2O и высушите покровное стекло на воздухе в течение нескольких минут.
- Разбавить наночастицы золота длиной волны 80 нм (см. Таблицу материалов) с ddH2O до 25% (v/v, OD600 = 0,07) (см. Таблицу материалов) и ультразвуковую обработку в течение 15 мин.
- Инкубируйте поверхность покровного стекла с разбавленными наночастицами золота в течение 1 ч при комнатной температуре (рис. 2C).
- Смойте ddH2O и высушите покровное стекло на воздухе в течение нескольких минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Он хорошо работает через 2 недели после покрытия наночастицами пиолоформа и золота. Но мы рекомендуем использовать его сразу после нанесения покрытия.
4. Ультратонкое секционирование
- Обрежьте поверхность блока образца в прямоугольную трапецию. Отрежьте срезы толщиной 100 нм с помощью алмазного ножа (см. Таблицу материалов) с ультрамикротомом (см. Таблицу материалов). Отделите одну секцию от секционной ленты и опустите одну секцию на водяную баню.
- Добавьте каплю ddH2O в центр покровного стекла с покрытием из наночастиц золота. Возьмите секцию с помощью петли образца и инвертируйте петлю образца на поверхность капли воды. Снимите петлю для образца, оставив участок на поверхности капли воды.
- Высушите покровное стекло на воздухе в течение нескольких минут. Нарисуйте маркером кольцо вокруг участка на противоположной стороне покровного стекла.
5. Визуализация с помощью световой микроскопии
- Восстановление флуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс показан на рисунке 3A.- Добавьте 10 мкл монтажного буфера (см. Таблицу материалов) на ультратонкую секцию покровного стекла. Поместите новое чистое защитное стекло на монтажный буфер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевым компонентом монтажного буфера является DABCO, который используется для восстановления флуоресценции флуоресцентных белков. Это очень важно для восстановления флуоресценции. - Поместите эти два покровных стекла вместе с ультратонкой частью в камеру визуализации (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что покровное стекло с нарисованным кольцевым пространством находится сверху.
- Добавьте 10 мкл монтажного буфера (см. Таблицу материалов) на ультратонкую секцию покровного стекла. Поместите новое чистое защитное стекло на монтажный буфер.
- Соберите навигационную карту.
- Найдите разрез, используя нарисованное кольцо в качестве маркера в режиме светлопольной визуализации инвертированного флуоресцентного микроскопа (см. таблицу материалов). Переместитесь в один угол раздела. Включите белый свет и сделайте снимок светлого поля.
- Выключите белый свет. Включите лазер (561 нм) и сделайте флуоресцентные снимки с тем же полем зрения (FOV).
- Выключите лазер. Перейдите к соседнему полю зрения, убедившись, что эти два поля зрения перекрываются на 10%. Возьмем светлопольное изображение и флуоресцентное изображение второго поля зрения.
- Повторяйте эту операцию до тех пор, пока не будет покрыт весь участок. Запишите путь изображения, который можно использовать для сшивания поля зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более высокого качества изображения мы рекомендуем использовать конфокальный микроскоп.
- Интересующие ячейки изображения.
- Используйте навигационную карту, чтобы легко нацеливаться на интересующие вас ячейки. Включите лазер (561 нм) и сделайте 300 кадров флуоресцентных снимков интересующей клетки. Выключите лазер.
- Включите белый свет и сделайте последовательные снимки светлого поля (~100 кадров).
- Переход в другую интересующую ячейку.
6. Подготовка к ЭМ-визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс показан на рисунке 3B.
- Перенесите ультратонкий срез на решетку прорезей.
- Наполните стеклянную банку ддН2О.
- Извлеките защитные стекла из камеры и разделите их пинцетом. Зажмите покровное стекло, на котором расположена секция, смойте монтажный буфер и высушите на воздухе.
- Нарежьте # вокруг ультратонкого участка с помощью одностороннего лезвия и капните 10 мкл 12% плавиковой кислоты (см. Таблицу материалов) в каждый угол #. Медленно опустите покровное стекло в воду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плавиковая кислота вступает в реакцию со стеклом, облегчая удаление пленки пиолоформ с покровного стекла. Плавиковая кислота токсична. Используйте его в химической вытяжке в перчатках. Контакт с кожей требует немедленной медицинской помощи. - Соедините пленку пиолоформ и ультратонкую часть на поверхности воды вместе. Поместите сетку прорезей без покрытия на секцию, чтобы захватить секцию в центре сетки.
- Накройте предметное стекло парапленкой (см. Таблицу материалов) и подберите сетку с помощью пленки-пиолоформ. Высушите сетку на воздухе при комнатной температуре.
- Окрашивание сечений
- Окрасьте участок 2% UA и тройным свинцом Сато. Для получения более подробной информации обратитесь к ранее опубликованному протоколу2.
7. Анализ изображений
- Сшейте навигационную карту.
- Найдите местоположение исходных данных. Откройте программу ImageJ (см. Таблицу материалов), чтобы сшить навигационную карту.
- Нажмите на Плагины | Сшивание | Сетка/Коллекционная строчка | (Тип) Сетка: змейка по столбцу | (Заказ) Вверх и влево (в соответствии с последовательностью съемки) | Установить размер среза | Выбор пути к данным | Задать имя файла | Установите флажок Display fusion. Обратите внимание на результат, который представляет собой навигационную карту, состоящую из нескольких яркопольных изображений различных полей зрения.
- Используйте тот же метод для сшивания флуоресцентной навигационной карты.
- Объедините изображения светлого поля с изображениями флуоресценции.
- В программе ImageJ нажмите на File | Импорт | Последовательность изображений для импорта последовательных изображений светлого поля интересующей ячейки.
- Нажмите на изображение | Стеки | Проекция по оси Z | Суммарные срезы для получения изображения суммарной проекции интенсивности (SIP) последовательных изображений светлого поля.
- Нажмите « Редактировать» | Инвертировать, чтобы инвертировать SIP-изображение яркого поля так, чтобы сигналы наночастиц золота стали яркими белыми точками.
- В ImageJ нажмите Файл | Импорт | Последовательность изображений для импорта последовательных FM-изображений.
- Нажмите на изображение | Стеки | Проекция по оси Z | Sum Slices для получения SIP-изображения последовательных FM-изображений.
- Нажмите на изображение | Цвет | Merge Channels (Объединить каналы ) для объединения изображения светлого поля SIP с изображением SIP FM в качестве составного изображения.
- Наночастицы золота зеленые, а флуоресцентный белок — красный. Нажмите на изображение | Тип | RGB Color для преобразования формата составного изображения в RGB.
8. Электромагнитная визуализация
- Положите сетку на держатель для образца, держа секцию стороной сетки вверх.
- Используйте навигационную карту, чтобы приблизительно определить положение соответствующих клеток под электронным микроскопом через четыре относительных расстояния до четырех различных углов правой трапеции ультратонкого сечения.
- Подтвердите клетки с помощью наночастиц золота.
- Сделайте электромагнитные изображения с разным увеличением (4200x, 6000x или 8200x) с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) (см. таблицу материалов).
9. Регистрация FM-изображения с EM-изображением
- Откройте регистрационную программу (см. Таблицу материалов). Введите easyCLEMv014в окне поиска. Нажмите easyCLEMv0, чтобы открыть easyCLEMv0. Нажмите на изображение/последовательность | Откройте , чтобы импортировать EM-образ и составное изображение в панель программного обеспечения.
- В окне EasyCLEMv0 нажмите на 2D (x,y,[T]) , чтобы выбрать нежесткий (2D или 3D) в качестве режима выравнивания.
- В окне EasyCLEMv0 нажмите на выпадающий список справа от Выбрать изображение, которое будет преобразовано и изменено (вероятно, FM), чтобы выбрать Композитный (RGB)color.tif. Затем нажмите на раскрывающийся список справа от Выбрать изображение, которое не будет изменено (скорее всего, EM), чтобы выбрать EMimage. tif.
- Нажмите « Начать », чтобы начать регистрацию.
- В окне ЭМ-изображения с именем EMimage. tif щелкните по одной наночастице золота, чтобы поместить точку 1 на наночастицу золота. В окне FM-изображения с именем Composite (RGB)color.tif нажмите на соответствующую золотую наночастицу, чтобы поместить точку 1 на золотую наночастицу.
- Нажмите на Update Transformation , чтобы подтвердить LM-сигнал электромагнитным сигналом золотых наночастиц.
- Повторите описанную выше операцию в окне ЭМ-изображения с именем EMimage. tif и поочередно сопоставьте LM-сигнал с ЭМ-сигналом той же золотой наночастицы.
- Нажмите « Стоп», чтобы завершить регистрацию.
- После выравнивания изображения нажмите на Наложенное изображение и нажмите на Изображение/Последовательность | Сохранить как , чтобы экспортировать стек изображений, содержащий изображения четырех каналов (красный, зеленый, синий, серый).
- Откройте ImageJ и нажмите Файл | Открыть , чтобы импортировать наложенное изображение. Нажмите на изображение | Стеки | Сложить в изображения , чтобы разделить наложенное изображение на четыре канала.
- Нажмите на изображение | Цвет | Объединить каналы , чтобы объединить изображения из трех каналов (красный, зеленый и серый) в составное изображение.
- Нажмите на изображение | Тип | RGB Color для преобразования составного изображения в изображение CLEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Предыдущие отчеты показали, что mScarlet может нацеливаться на лизосому15. В этом протоколе AAV, экспрессирующий mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA), вводили в M1 (ML: ±1,2 AP: +1,3 DV: -1,5) мозга мыши Vglut2-ires-cre с помощью стереотаксических инструментов. В соответствии с протоколом, описанным выше, окончательное коррелированное изображение показано на рисунке 4A. FM-изображение может быть точно выровнено с электромагнитным изображением, используя наночастицы золота (зеленые точки) в качестве реперных маркеров. Как показано на ЭМ-изображении (рис. 4C, F), mScarlet нацелен на лизосому, и содержимое внутри лизосом неоднородно, что является типичными характеристиками вторичной лизосомы.
Рисунок 1: Схематический обзор коррелятивной световой и электронной микроскопии. (А) Подготовка мозга мыши. Аденоассоциированные вирусы были введены в мозг мыши. Через 30 дней флуоресцентные участки срезов мозга мышей были разрезаны на небольшие блоки для подготовки ЭМ-образца. (B) Подготовка образцов ЭМ. (C) Ультратонкий срез с помощью алмазного ножа и принципиальной схемы покровного стекла. (D) ФМ-визуализация и ПЭМ-визуализация. Сокращения: ЭМ = электронная микроскопия; FM = флуоресцентная микроскопия; ПЭМ = просвечивающая электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Покрытие покровных стекол наночастицами золота. (A) Накройте покровное стекло пиолоформой путем центрифугирования. (B) Инкубируйте поверхность покровного стекла с поли-L-лизином. (C) Инкубируйте поверхность покровного стекла с разбавленными наночастицами золота. (D) Принципиальная схема покровного стекла с покрытием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: График подготовки к ФМ-визуализации и ЭМ-визуализации. (A) Рабочий процесс подготовки к ФМ-визуализации состоит из пяти этапов: (i) зачерпывание ультратонкого участка, (ii) сушка на воздухе, (iii) установка второго покровного стекла после добавления буфера, (iv) фиксация обоих покровных очков в камере и FM-визуализация. (B) Рабочий процесс подготовки к ЭМ-визуализации также состоит из пяти этапов: (i) разделение двух покровных стекол, (ii) плавающий ультратонкий срез, (iii) захват ультратонкого участка, (iv) перемещение ультратонкого участка на сетку щели и (v) электромагнитная визуализация. Сокращения: ЭМ = электронная микроскопия; FM = флуоресцентная микроскопия; ПЭМ = просвечивающая электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативное CLEM-изображение mScarlet. (A) Изображение CLEM всего нейрона. (Б,Д) Изображения CLEM врезки. (С,Ж) Электромагнитные изображения врезки. (Д,Г) Флуоресцентные изображения врезки. Зелеными точками обозначены наночастицы золота. Масштабная линейка = 5 мкм (А), 1 мкм (врезные изображения). Сокращения: ЭМ = электронная микроскопия; FM = флуоресцентная микроскопия; CLEM = коррелятивная световая и электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь протокол представляет собой универсальный метод визуализации, который может сочетать информацию о локализации белка-мишени из световой микроскопии (ЛМ) и контекст, окружающий белок-мишень из электронной микроскопии (ЭМ)6. В связи с ограничениями, присущими современным флуоресцентным белкам, широко используемым методом является предварительное встраивание коррелятивной световой и электронной микроскопии (CLEM), что означает, что визуализация LM выполняется до подготовки ЭМ-образца. Почти все существующие флуоресцентные белки могут быть исследованы при предварительном встраивании КЛЭМ. Однако из-за неизбежных искажений и усадок точное выравнивание конечного изображения невозможно6. Таким образом, информация, предоставляемая предварительным внедрением CLEM, предназначена для проверки ультраструктур одной и той же клетки, визуализированной LM в ЭМ-визуализации.
Метод, представленный в этом исследовании, представляет собой поствстраивание CLEM, при котором визуализация LM выполняется после подготовки ЭМ-образца. Усадка, вызванная химической фиксацией при подготовке образцов ЭМ, не влияет на точное выравнивание конечного изображения. Кроме того, поскольку и LM-визуализация, и электромагнитная визуализация выполняются на одном и том же участке и с помощью золотых наночастиц, окончательное выравнивание изображения может быть очень точным. После встраивания КЛЭМ требует, чтобы флуоресцентные белки сохраняли флуоресцентный сигнал после обычной ЭМ-пробоподготовки. Ранее мы сообщали о первом флуоресцентном белке под названием mEosEM, который может удерживать флуоресцентные сигналы, используя Epon в качестве встраивающей смолы8. По сравнению с другими смолами в качестве встраиваемых смол, Epon обладает превосходными свойствами сохранения ультраструктуры и секционирования. После mEosEM были обнаружены другие резистентные флуоресцентные белки, встраивающие Epon, такие как mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 и HfYFP 9.
По нашему опыту, mScarlet превосходит другие флуоресцентные белки. Фиксирующий раствор может влиять на флуоресценцию флуоресцентных белков. В целом, скорость фиксации параформальдегида (ПФА) значительно медленнее, чем у глутарового альдегида (ГА); И наоборот, PFA проникает в образец быстрее, чем более крупная GA. Смесь PFA и GA обеспечивает баланс между достаточно быстрой фиксацией образца, чтобы сохранить его качество, и достаточно медленной, чтобы не произошло повреждения образца, такого как окисление. Более высокая концентрация GA будет производить более высокую автофлуоресценцию. По нашему опыту, флуоресценция mScarlet в блоке смолы может быть обнаружена через 6 месяцев после полимеризации. Но мы рекомендуем делать CLEM-визуализацию сразу после полимеризации.
Еще одним ключевым фактором при поствстраивании CLEM является точная регистрация LM-образа с EM-изображением. Основываясь на ранее описанных методах 6,21, мы внесли некоторые изменения в протокол. Во-первых, как найти ту же самую клетку, которую визуализирует LM при ЭМ-визуализации. Мы взяли разные поля зрения, чтобы сшить навигационную карту всего ультратонкого участка с помощью DIC и режима флуоресцентной визуализации. С помощью навигационной карты можно легко идентифицировать интересующие ячейки. Еще одним улучшением является точное выравнивание изображения. Ранее в качествемаркеров реперного выравнивания 6 использовали флуоресцентный сигнал в режиме флуоресцентной визуализации и сигнал с высоким электронным контрастом в режиме ЭМ-визуализации наночастиц золота. Однако при использовании mScarlet флуоресцентный сигнал mScarlet был намного выше, чем флуоресцентный сигнал наночастиц золота, и было трудно обнаружить флуоресцентный сигнал наночастиц золота. Для решения этой задачи вместо флуоресцентного сигнала мы использовали для регистрации светлопольный сигнал наночастиц золота. Следуя этому модифицированному протоколу, было легко выполнить CLEM после встраивания.
Тем не менее, существуют некоторые ограничения текущего протокола, которые следует учитывать перед его использованием. Несмотря на то, что флуоресценция хорошо работает в системе гиперэкспрессии, она довольно слабая, если белки-мишени находятся под своим нативным промотором22. Еще одно ограничение заключается в том, что, хотя mScarlet является лучшим флуоресцентным белком (согласно нашему опыту), который может удерживать достаточное количество флуоресцентных сигналов после подготовки образцов ЭМ и хорошо работает в клетках млекопитающих, он будет проблемой при использовании mScarlet в качестве флуоресцентной метки в нейронах, что может привести к ошибочному расположению белков-мишеней15. В этих случаях мы предлагаем использовать oScarlet15, мутацию mScarlet, которая хорошо работает в нейронах.
Потенциальные применения этого модифицированного протокола можно разделить на две категории. Во-первых, это приближение к субклеточному уровню, что означает изучение целевого белка в субклеточном контексте. В наших ранее опубликованных отчетах мы использовали поствстраивание CLEM для изучения образования компартментов сборки цитоплазматического вириона (cVAC) во время инфекции γ-герпесвирусом23. В будущих приложениях после встраивания КЛЭМ может быть объединен с электронной томографией для получения 3D-распределения белков-мишеней и решения 3D-структуры24. Второй тип потенциального применения — это уменьшение масштаба до клеточного уровня, который может быть использован для рисования и анализа нейронных цепей. Благодаря высокому разрешению, ЭМ стала эффективным средством картирования тонких мозговых связей. Тем не менее, ЭМ не может точно определить идентичность нейронов, что ограничивает углубленный анализ нейронной цепи. Epon после встраивания CLEM обладает потенциалом для переноса идентичности нейронов в нейронную цепь без ущерба для ультраструктур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (32201235 Zhifei Fu), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2022J01287 Zhifei Fu), Исследовательским фондом передовых талантов при Фуцзяньском медицинском университете, Китай (XRCZX2021013 Zhifei Fu), Финансовым специальным научным фондом провинции Фуцзянь, Китай (22SCZZX002 Zhifei Fu), Основание Ключевой лаборатории технической оценки регуляции фертильности нечеловекообразных приматов NHC и Фуцзяньской больницы материнства и здоровья ребенка (2022-NHP-04 to Zhifei Fu). Мы благодарим Линьин Чжоу, Минся Ву, Си Линя и Янь Ху из Центра обслуживания государственных технологий Фуцзяньского медицинского университета за помощь в подготовке образцов для ЭМ и ЭМ-визуализации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
