Summary
Vi presenterar ett detaljerat protokoll för Epon post-embedding korrelativ ljus- och elektronmikroskopi med hjälp av ett fluorescerande protein som kallas mScarlet. Denna metod kan bibehålla fluorescensen och ultrastrukturen samtidigt. Denna teknik är mottaglig för en mängd olika biologiska tillämpningar.
Abstract
Korrelativ ljus- och elektronmikroskopi (CLEM) är en omfattande mikroskopi som kombinerar lokaliseringsinformationen från fluorescensmikroskopi (FM) och kontexten för cellulär ultrastruktur som förvärvats med elektronmikroskopi (EM). CLEM är en avvägning mellan fluorescens och ultrastruktur, och vanligtvis kompromissar ultrastruktur fluorescens. Jämfört med andra hydrofila inbäddningshartser, såsom glycidylmetakrylat, HM20 eller K4M, är Epon överlägsen när det gäller ultrastrukturbevarande och sektioneringsegenskaper. Tidigare har vi visat att mEosEM kan överleva osmiumtetroxidfixering och eponinbäddning. Med hjälp av mEosEM uppnådde vi för första gången Epon post embedding CLEM, som bibehåller fluorescensen och ultrastrukturen samtidigt. Här ger vi steg-för-steg-detaljer om EM-provberedningen, FM-avbildningen, EM-avbildningen och bildjusteringen. Vi förbättrar också procedurerna för att identifiera samma cell som avbildats med FM-avbildning under EM-avbildningen och detaljerar registreringen mellan FM- och EM-bilderna. Vi tror att man enkelt kan uppnå Epon efter inbäddning av korrelativ ljus- och elektronmikroskopi genom att följa detta nya protokoll i traditionella EM-anläggningar.
Introduction
Fluorescensmikroskopi (FM) kan användas för att erhålla lokalisering och distribution av målproteinet. Sammanhanget som omger målproteinet går dock förlorat, vilket är avgörande för att kunna undersöka målproteinet grundligt. Elektronmikroskopi (EM) har den högsta bildupplösningen och ger flera subcellulära detaljer. EM saknar dock målmärkning. Genom att noggrant sammanfoga fluorescensbilden som tagits av FM med den grå bilden som tagits av EM kan korrelativ ljus- och elektronmikroskopi (CLEM) kombinera informationen som erhålls av dessa två avbildningslägen 1,2,3,4.
CLEM är en avvägning mellan fluorescens och ultrastruktur1. På grund av begränsningarna hos nuvarande fluorescerande proteiner och de traditionella EM-provberedningsprocedurerna, särskilt användningen av osmisk syra (OsO4) och hydrofoba hartser som Epon, äventyrar ultrastrukturen alltid fluorescens5. OsO4 är ett oumbärligt reagens vid EM-provberedning, som används för att förbättra kontrasten i EM-bilder. Jämfört med andra inbäddningshartser är Epon överlägsen när det gäller ultrastrukturbevarande och sektioneringsegenskaper5. Inga fluorescerande proteiner kan dock behålla fluorescenssignalen efter behandling med OsO4 och Epon embedding6. För att övervinna begränsningarna hos fluorescerande proteiner utvecklades pre embedding CLEM, där FM-avbildning görs före EM-provberedning6. Nackdelen med förinbäddning av CLEM är dock den oprecisa registreringen mellan FM- och EM-bilderna5.
Tvärtom utför CLEM-metoden efter inbäddning FM-avbildningen efter EM-provberedningen, vars registreringsnoggrannhet kan nå 6-7 nm 5,6. För att bibehålla fluorescensen hos fluorescerande proteiner har mycket låga koncentrationer av OsO4 (0,001%)3 eller EM-preparationsmetoderna 4,7 med fryst under högt tryck (HPF) och fryssubstitution (FS) använts på bekostnad av komprometterad ultrastruktur eller kontrasten i EM-bilden. Utvecklingen av mEos4b främjar i hög grad framstegen med CLEM efter inbäddning, även om glycidylmetakrylat används som inbäddningsharts5. Med utvecklingen av mEosEM, som kan överleva OsO4-färgning och Epon-inbäddning, uppnåddes Epon för första gången med superupplösning CLEM efter inbäddning, vilket bibehöll fluorescensen och ultrastrukturen samtidigt6. Efter mEosEM utvecklades flera fluorescerande proteiner som kan överleva OsO4-färgningen och Epon-inbäddningen 8,9,10,11. Detta främjar i hög grad utvecklingen av CLEM.
Det finns tre viktiga aspekter av Epon efter inbäddning av CLEM. Det första är det fluorescerande proteinet, som ska bibehålla den fluorescerande signalen efter EM-provberedning. Enligt vår erfarenhet är mScarlet överlägset andra rapporterade fluorescerande proteiner. Den andra är hur man hittar samma cell avbildad med FM-avbildning i EM-avbildning. För att lösa detta problem förbättrar vi proceduren för detta steg så att man lätt kan hitta målcellen. Den sista är metoden för att justera FM-bilden med EM-bilden. Här beskriver vi registreringen mellan FM- och EM-bilderna. I detta protokoll uttrycker vi mScarlet i VGLUT2-neuroner och visar att mScarlet kan rikta in sig på sekundära lysosomer med hjälp av Epon post-embedding CLEM. Vi tillhandahåller steg-för-steg-detaljer för Epon efter inbäddning av CLEM, utan att kompromissa med fluorescensen och ultrastrukturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurhållning och experiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Fujian Medical University Medical Center. Det stegvisa arbetsflödet för det aktuella protokollet visas i figur 1.
1. Beredning av prover
- Mus hjärna
- Köp transgena möss (se materialförteckning) och oligonukleotidprimrar (se materialförteckning) för att genotypa dessa möss.
- Perfuse och ta bort den intakta hjärnan från kranialvalvet enligt tidigare publicerat protokoll 12,13.
- Fixera mushjärnan med 10 ml fixeringslösning (se materialförteckning) vid 4 °C över natten.
- Skölj av fixeringslösningen i 3 x 10 minuter med 0,1 M fosfatbuffert (PB).
- Skär mushjärnan i sektioner med en tjocklek på 500 μm med hjälp av en oscillerande mikrotom (se materialförteckning).
- Skär de fluorescerande områdena i små block med en skalpell med hjälp av ett stereomikroskop (se materialförteckning).
OBS: Volymen på de små blocken får inte vara större än 1 mm3.
- Odlade celler
- Frö HeLa-celler i 6 cm cellodlingsskålar och håll dem i tillväxtmedium (Dulbeccos modifierade Eagle medium [DMEM] låga glukos, kompletterat med 10% fetalt bovint serum [FBS]).
- Följande dag transfekterar plasmiderna som innehåller mScarlet in i celler med hjälp av DNA-transfektionsreagens (se materialtabell) enligt instruktionsboken för transfektionssatsen.
- Fyrtioåtta timmar efter transfektionen, trypsinisera de transfekterade cellerna och centrifugera dem för att erhålla cellpellets vid 1 000 × g. Cellpelletsen kallas provblock.
2. Beredning av EM-prov
- Fixering
- Fixera provblocken med en fixativ lösning (se materialtabell) vid 4 °C över natten.
- Ta bort fixeringslösningen och skölj av fixeringslösningen i 3 x 10 minuter med 0,1 M PB från provblocken.
- Osmiumtetroxid (OsO4) färgning
- Fixera provblocken med OsO4-lösning (se materialtabell) vid 4 °C i 1 timme.
- Ta bort OsO4-lösningen och skölj av OsO4-lösningen 3 x 10 min med ddH2O från provblocken.
- Uranylacetat (UA) färgning
- Färga provblocken med 2 % UA-lösning (se materialtabell) vid 4 °C i 1 timme.
- Ta bort UA-lösningen och skölj provblocken med ddH2O i 3 x 10 minuter.
- Gradient uttorkning
- Torka provblocken med gradientetanol enligt följande: 50 % i 10 min, 70 % i 10 min, 80 % i 10 min, 90 % i 10 min och 2 x 10 min i 100 % etanol.
- Torka provblocken med vattenfri aceton i 3 x 10 minuter.
- Infiltration av harts
- Infiltrera provblocken med gradientharts (se materialförteckning): aceton till harts 3:1 i 1 timme, aceton till harts 1:1 i 2 timmar, aceton till harts 1:3 i 3 timmar.
- Byt ut mot rent harts i 3 x 12 timmar.
- Inbäddning av harts
- Överför provblocken till kapslar (se materialförteckningen) med hjälp av en tandpetare.
- Tillsätt rent harts till kapseln som innehåller provblocket och polymerisera hartset i ugnen vid 60 °C i 14-16 timmar.
3. Beläggning av täckglaset med guldnanopartiklar
- Rengöring av täckglas
- Tvätta täckglasen med rengöringsbuffert (se materialtabell) i 2 timmar vid 142 °C.
- Skölj av rengöringsbufferten 3 x 10 min med ddH2O.
- Överför täckglasen försiktigt till en bägare som innehåller vattenfri etylalkohol och inkubera över natten.
- Lufttorka täckglasen på en ren bänk i flera minuter.
- Täckglasen är täckta med nanopartiklar av guld.
- Fäst en glasskiva i mitten av rotationen av en skrivbordscentrifug (se materialtabell) med hjälp av glascement.
- Montera ett täckglas i mitten av glasglaset med hjälp av klisterlappar.
- Tillsätt 75 μL 1 % pioloform (se Materialtabell) på täckglaset.
OBS: Vi har även testat Formvar (se Materialförteckning) och det fungerar bra. - Centrifugera i 3 minuter vid 1 360 × g (Figur 2A) för att få ett tunt lager pioloform på täckglasets yta.
- Inkubera täckglasytan med 250 μL 0,1 % poly-L-lysin (se materialtabell) i 1 timme vid rumstemperatur (figur 2B).
- Skölj med ddH2O och lufttorka täckglaset i flera minuter.
- Späd 80 nm guldnanopartiklar (se materialtabell) med ddH2O till 25 % (v/v, OD600 = 0,07) (se materialtabell) och ultraljudsbehandla i 15 min.
- Inkubera täckglasytan med de utspädda guldnanopartiklarna i 1 timme vid rumstemperatur (figur 2C).
- Skölj med ddH2O och lufttorka täckglaset i flera minuter.
OBS: Det fungerar bra 2 veckor efter att ha belagts med pioloform och guldnanopartiklar. Men vi rekommenderar att du använder den direkt efter att den har belagts.
4. Ultratunn sektionering
- Trimma ytan på provblocket till en rätvinklig trapets. Skär sektioner med en tjocklek av 100 nm med en diamantkniv (se Materialförteckning) med en ultramikrotom (se Materialförteckning). Separera en enda sektion från sektionsbandet och flyt den enda sektionen i vattenbadet.
- Tillsätt en droppe ddH2O på mitten av det guldnanopartikelbelagda täckglaset. Plocka upp en sektion med hjälp av en sample loop och invertera sample slinga på ytan av vattendroppen. Ta bort sampöglan och lämna sektionen på vattendroppens yta.
- Lufttorka täckglaset i flera minuter. Rita en ring runt delen på motsatt sida av täckglaset med en tuschpenna.
5. Ljusmikroskopiavbildning
- Återhämtning av fluorescens
OBS: Arbetsflödet visas i figur 3A.- Tillsätt 10 μL monteringsbuffert (se materialtabell) på den ultratunna delen på täckglaset. Placera ett nytt rent täckglas på monteringsbufferten.
OBS: Nyckelkomponenten i monteringsbufferten är DABCO, som används för att återvinna fluorescensen hos fluorescerande proteiner. Detta är mycket viktigt för att återfå fluorescens. - Sätt ihop dessa två täckglas med den ultratunna sektionen i en bildkammare (se materialförteckning). Se till att täckglaset med den ritade ringen är på toppen.
- Tillsätt 10 μL monteringsbuffert (se materialtabell) på den ultratunna delen på täckglaset. Placera ett nytt rent täckglas på monteringsbufferten.
- Samla in navigationskartan.
- Hitta avsnittet med den ritade ringen som markör i ljusfältsavbildningsläge för ett inverterat fluorescensmikroskop (se materialförteckning). Flytta till ett hörn av avsnittet. Slå på det vita ljuset och ta ljusfältsbilden.
- Stäng av det vita ljuset. Slå på lasern (561 nm) och ta fluorescerande bilder av samma synfält (FOV).
- Stäng av lasern. Flytta till intilliggande FOV och se till att dessa två FOV har en överlappning på 10 %. Ta ljusfältsbilden och den fluorescerande bilden av den andra synfältet.
- Upprepa denna operation tills hela sektionen är täckt. Anteckna avbildningssökvägen som kan användas för att sammanfoga synfältet.
OBS: För högre bildkvalitet rekommenderar vi att du använder konfokalmikroskopet.
- Bildceller av intresse.
- Använd navigeringskartan för att enkelt rikta in dig på celler av intresse. Slå på lasern (561 nm) och ta 300 bilder av fluorescerande bilder av den aktuella cellen. Stäng av lasern.
- Slå på det vita ljuset och ta sekventiella ljusfältsbilder (~100 bilder).
- Flytta till en annan cell av intresse.
6. Förberedelse för EM-avbildning
OBS: Arbetsflödet visas i figur 3B.
- Överför den ultratunna sektionen till spårgallret.
- Fyll en glasburk med ddH2O.
- Ta bort täckglasen från kammaren och separera de två täckglasen med pincett. Clamp täckglaset som sektionen är placerad på, tvätta av monteringsbufferten och lufttorka.
- Skåra ett # runt den ultratunna sektionen med ett enkelsidigt blad och släpp 10 μL 12 % fluorvätesyra (se materialtabell) i varje hörn av #. Lägg täckglaset långsamt i vattnet.
OBS: Fluorvätesyra reagerar med glas, vilket gör det lättare att ta bort den pioloforma filmen från täckglaset. Fluorvätesyra är giftigt. Använd den i en kemisk huva med handskar. Kontakt med huden kräver omedelbar läkarvård. - Flyt den pioloforma filmen och den ultratunna sektionen på vattenytan tillsammans. Sätt ett obestruket spårgaller på sektionen för att fånga sektionen i mitten av rutnätet.
- Täck en glasskiva med parafilm (se Materialtabell) och plocka upp gallret med den pioloforma filmen. Lufttorka gallret i rumstemperatur.
- Färgning av sektion
- Fläcka sektionen med 2% UA och Satos trippelledning. För mer information, se det tidigare publicerade protokoll2.
7. Bildanalys
- Sy ihop navigationskartan.
- Hitta platsen för rådata. Öppna programvaran ImageJ (se Materialförteckning) för att sy ihop navigationskartan.
- Klicka på Plugins | Sömmar | Rutnät/Kollektionssömmar | (Typ) Rutnät: orm efter kolumn | (Beställ) Upp och vänster (enligt fotograferingssekvensen) | Ställ in segmentstorlek | Välj datasökväg | Ange filnamn | Kontrollera Bildskärmsfusion. Observera resultatet, som är en navigeringskarta som består av flera ljusfältsbilder av olika synfält.
- Använd samma metod för att sy ihop en fluorescensnavigeringskarta.
- Sammanfoga ljusfältsbilderna med fluorescensbilderna.
- I programvaran ImageJ klickar du på Arkiv | Import | Bildsekvens för att importera de sekventiella ljusfältsbilderna av cellen av intresse.
- Klicka på Bild | Travar | Z-projektion | Sum Slices för att få SIP-bilden (Sum Intensity Projection) av de sekventiella ljusfältsbilderna.
- Klicka på Redigera | Invertera för att invertera SIP-bilden av ljusfältet så att signalerna från guldnanopartiklarna blir ljusa vita prickar.
- I ImageJ klickar du på Arkiv | Import | Bildsekvens för att importera de sekventiella FM-bilderna.
- Klicka på Bild | Travar | Z-projektion | Summera skivor för att få SIP-bilden av de sekventiella FM-bilderna.
- Klicka på Bild | Färg | Slå samman kanaler för att slå samman SIP-ljusfältsbilden med SIP FM-bilden som en sammansatt bild.
- Guldnanopartiklarna är gröna och det fluorescerande proteinet är rött. Klicka på Bild | Typ | RGB-färg för att konvertera den sammansatta bildens format till RGB.
8. EM-avbildning
- Sätt gallret på sample håll, håll sektionssidan av gallret uppåt.
- Använd navigationskartan för att grovt identifiera positionen för motsvarande celler under ett elektronmikroskop genom fyra relativa avstånd till de fyra olika hörnen av den högra trapetsen i den ultratunna sektionen.
- Bekräfta cellerna med hjälp av guldnanopartiklarna.
- Ta EM-bilder med olika förstoringar (4 200x, 6 000x eller 8 200x) med ett transmissionselektronmikroskop (TEM) (se materialtabell).
9. Registrering av FM-bilden med EM-bilden
- Öppna registreringsprogrammet (se Materialförteckning). Skriv easyCLEMv014i sökfönstret. Klicka på easyCLEMv0 för att öppna easyCLEMv0. Klicka på Bild/sekvens | Öppna för att importera EM-bilden och den sammansatta bilden till panelen i programvaran.
- I EasyCLEMv0-fönstret, klicka på 2D (x,y,[T]) för att välja icke-stel (2D eller 3D) som inriktningsläge.
- I EasyCLEMv0-fönstret klickar du på rullgardinsmenyn till höger om Välj bild som ska transformeras och ändras i storlek (troligen FM) för att välja Sammansatt (RGB) color.tif. Klicka sedan på rullgardinsmenyn till höger om Välj bild som inte kommer att ändras (troligen EM) för att välja EMimage. tif.
- Klicka på Start för att påbörja registreringen.
- I EM-bildfönstret med namnet EMimage. tif klickar du på en guldnanopartikel för att sätta punkt 1 på guldnanopartikeln. I FM-bildfönstret med namnet Komposit (RGB) color.tif klickar du på motsvarande guldnanopartikel för att sätta punkt 1 på guldnanopartikeln.
- Klicka på Uppdatera transformation för att bekräfta LM-signalen med EM-signalen från guldnanopartiklarna.
- Upprepa ovanstående operation i EM-bildfönstret med namnet EMimage. tif och matcha LM-signalen med EM-signalen från samma guldnanopartikel en efter en.
- Klicka på Stopp för att avsluta registreringen.
- Efter bildjustering klickar du på Överlagrad bild och klickar på Bild/sekvens | Spara som om du vill exportera en bildstapel som innehåller fyra kanalbilder (röd, grön, blå, grå).
- Öppna ImageJ och klicka på Arkiv | Öppna för att importera den överlagrade bilden. Klicka på Bild | Travar | Stapla till bilder för att dela upp den överlagrade bilden i fyra kanalbilder.
- Klicka på Bild | Färg | Sammanfoga kanaler om du vill sammanfoga bilder från tre kanaler (röd, grön och grå) till en sammansatt bild.
- Klicka på Bild | Typ | RGB-färg för att konvertera den sammansatta bilden till en CLEM-bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidigare rapporter har visat att mScarlet kan rikta in sig på lysosom15. I detta protokoll injicerades AAV-uttryckande mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) i M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) i Vglut2-ires-cre-mushjärnan med hjälp av stereotaktiska instrument. Enligt protokollet som beskrivs ovan visas den slutliga korrelerade bilden i figur 4A. FM-bilden kan justeras exakt med EM-bilden med hjälp av guldnanopartiklar (de gröna prickarna) som fiduciella markörer. Som visas i EM-bilden (Figur 4C,F) riktade mScarlet in sig på lysosomen, och innehållet inuti lysosomerna är heterogent, vilket är de typiska egenskaperna hos den sekundära lysosomen.
Figur 1: Schematisk översikt över korrelativ ljus- och elektronmikroskopi. (A) Förberedelse av mushjärna. Adeno-associerade virus injicerades i mushjärnan. Efter 30 dagar skars de fluorescerande områdena av mushjärnskivor i små block för EM-provberedning. B) Beredning av EM-prover. (C) Ultratunn sektion med en diamantkniv och det schematiska diagrammet över täckglaset. D) FM-avbildning och TEM-avbildning. Förkortningar: EM = elektronmikroskopi; FM = fluorescensmikroskopi; TEM = transmissionselektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beläggning av täckglas med guldnanopartiklar. (A) Täck täckglaset med pioloform genom centrifugering. (B) Inkubera täckglasets yta med poly-L-lysin. (C) Inkubera täckglasets yta med de utspädda guldnanopartiklarna. (D) Schematisk bild av det belagda täckglaset. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schema för förberedelser för FM-avbildning och EM-avbildning. (A) Arbetsflödet för förberedelserna för FM-avbildning består av fem steg: (i) skopning av den ultratunna sektionen, (ii) lufttorkning, (iii) placering av ett andra täckglas efter tillsats av bufferten, (iv) fixering av båda täckglasen i kammaren och FM-avbildning. (B) Arbetsflödet för förberedelserna för EM-avbildning består också av fem steg: (i) separering av de två täckglasen, (ii) flytande den ultratunna sektionen, (iii) skopning av den ultratunna sektionen, (iv) förflyttning av den ultratunna sektionen till spårgallret och (v) EM-avbildning. Förkortningar: EM = elektronmikroskopi; FM = fluorescensmikroskopi; TEM = transmissionselektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativ CLEM-bild av mScarlet. (A) CLEM-bilden av hela neuronen. (B,E) CLEM-bilderna av den infällda bilden. (C,F) EM-bilderna av den infällda bilden. (D,G) Fluorescensbilderna av den infällda. Gröna prickar indikerar guldnanopartiklar. Skalstreck = 5 μm (A), 1 μm (infällda bilder). Förkortningar: EM = elektronmikroskopi; FM = fluorescensmikroskopi; CLEM = korrelativ ljus- och elektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här är en mångsidig avbildningsmetod, som kan kombinera lokaliseringsinformationen för målproteinet från ljusmikroskopi (LM) och kontexten kring målproteinet från elektronmikroskopi (EM)6. Med de begränsningar som nuvarande fluorescerande proteiner har, är den allmänt använda metoden pre-embedding correlative light and electron microscopy (CLEM), vilket innebär att LM-avbildningen görs före EM-provberedningen. Nästan alla existerande fluorescerande proteiner kan undersökas i pre-embedding CLEM. Men på grund av de oundvikliga förvrängningarna och krympningarna ärdet omöjligt att justera den slutliga bilden korrekt 6. Därför är informationen som tillhandahålls genom förinbäddning av CLEM att kontrollera ultrastrukturerna i samma cell avbildad av LM i EM-avbildning.
Metoden som tillhandahålls av denna studie är post-embedding CLEM, där LM-avbildning görs efter EM-provberedning. Krympningen som orsakas av den kemiska fixeringen vid EM-provberedning påverkar inte den slutliga bildens exakta inriktning. Dessutom, eftersom både LM-avbildning och EM-avbildning görs på samma sektion och med hjälp av guldnanopartiklar, kan den slutliga bildjusteringen bli mycket exakt. Efter inbäddning av CLEM krävs att de fluorescerande proteinerna bibehåller en fluorescerande signal efter konventionell EM-provberedning. Tidigare har vi rapporterat om det första fluorescerande proteinet mEosEM, som kan behålla fluorescerande signaler med hjälp av Epon som inbäddningsharts8. Jämfört med andra hartser som inbäddningshartser har Epon överlägsna ultrastrukturbevarande och sektioneringsegenskaper. Efter mEosEM har andra resistenta Epon-inbäddande fluorescerande proteiner rapporterats, såsom mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi 10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 och HfYFP9.
Enligt vår erfarenhet är mScarlet överlägset andra fluorescerande proteiner. Fixativ lösning kan påverka fluorescensen hos fluorescerande proteiner. I allmänhet är fixeringshastigheten för paraformaldehyd (PFA) mycket långsammare än för glutaraldehyd (GA); omvänt penetrerar PFA provet snabbare än den större GA. En blandning av PFA och GA ger en balans mellan att fixera provet tillräckligt snabbt för att dess kvalitet bibehålls men tillräckligt långsamt för att provskador som oxidation inte uppstår. Den högre GA-koncentrationen kommer att ge högre autofluorescens. Av vår erfarenhet kan fluorescensen av mScarlet i hartsblock detekteras 6 månader efter polymerisation. Men vi rekommenderar att du gör CLEM-avbildning omedelbart efter polymerisation.
En annan viktig faktor vid efterinbäddning av CLEM är hur LM-bilden ska registreras med EM-bilden korrekt. Baserat på tidigare rapporterade metoder 6,21 gjorde vi några ändringar i protokollet. Den första är hur man hittar samma cell avbildad av LM i EM-avbildning. Vi tog olika synfält för att sy ihop navigationskartan för hela den ultratunna sektionen med hjälp av DIC och fluorescensavbildningsläge. Med hjälp av navigationskartan kunde de intressanta cellerna lätt identifieras. En annan förbättring är korrekt bildjustering. Tidigare använde vi den fluorescerande signalen i fluorescensavbildningsläge och en högelektronkontrastsignal i EM-avbildningsläget för guldnanopartiklarna som fiduciella inriktningsmarkörer6. Men när man använde mScarlet var den fluorescerande signalen från mScarlet mycket högre än den fluorescerande signalen från guldnanopartiklarna och det var svårt att detektera den fluorescerande signalen från guldnanopartiklar. För att lösa detta problem använde vi ljusfältssignalen från guldnanopartiklarna för registrering istället för den fluorescerande signalen. Efter detta modifierade protokoll var det enkelt att utföra CLEM efter inbäddning.
Det finns dock vissa begränsningar i det nuvarande protokollet, som bör beaktas innan du använder det. Även om det fungerar bra i överuttryckssystemet är fluorescensen ganska svag om målproteinerna är under sin naturliga promotor22. En annan begränsning är att även om mScarlet är det bästa fluorescerande proteinet (enligt vår erfarenhet) som kan behålla tillräckligt med fluorescenssignaler efter EM-provberedning och fungerar bra i däggdjursceller, kommer det att vara ett problem när man använder mScarlet som en fluorescerande tagg i nervceller, vilket kan leda till fel placering av målproteinerna15. I dessa fall föreslår vi att du använder oScarlet15, en mutation av mScarlet, som fungerar bra i neuroner.
De potentiella tillämpningarna av detta modifierade protokoll kan delas in i två kategorier. Det första är att zooma in på den subcellulära nivån, vilket innebär att studera målproteinet i den subcellulära kontexten. I våra tidigare publicerade rapporter använde vi post-embedding CLEM för att undersöka bildandet av cytoplasmatiska virionkompartment (cVAC) under infektion med ett γ-herpesvirus23. I framtida tillämpningar kan post-embedding CLEM kombineras med elektrontomografi för att erhålla 3D-fördelningen av målproteinerna och lösa 3D-strukturen naturligt24. Den andra typen av potentiell tillämpning är att zooma ut till cellulär nivå, som kan användas för att rita och analysera neurala kretsar. På grund av sin högupplösta förmåga har EM blivit ett effektivt sätt att kartlägga fina hjärnkopplingar. EM kan dock inte exakt tillhandahålla neuronernas identiteter, vilket begränsar den djupgående analysen av neuronalkretsen. Epon post-embedding CLEM har potential att föra in neuronernas identiteter i neuronalkretsen utan att äventyra ultrastrukturerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av National Natural Science Foundation of China (32201235 till Zhifei Fu), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (2022J01287 till Zhifei Fu), Research Foundation for Advanced Talents vid Fujian Medical University, Kina (XRCZX2021013 till Zhifei Fu), Finance Special Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (22SCZZX002 till Zhifei Fu), Grundandet av NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, och Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 till Zhifei Fu). Vi tackar Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin och Yan Hu vid Public Technology Service Center, Fujian Medical University för stöd med EM-provberedning och EM-avbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
