Summary
Apresentamos um protocolo detalhado para microscopia eletrônica e de luz correlativa pós-incorporação de Epon usando uma proteína fluorescente chamada mScarlet. Este método pode manter a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Esta técnica é passível de uma ampla variedade de aplicações biológicas.
Abstract
A microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM) é uma microscopia abrangente que combina as informações de localização fornecidas pela microscopia de fluorescência (FM) e o contexto da ultraestrutura celular adquirida pela microscopia eletrônica (ME). CLEM é um trade-off entre fluorescência e ultraestrutura e, geralmente, a ultraestrutura compromete a fluorescência. Em comparação com outras resinas de incorporação hidrofílica, como metacrilato de glicidila, HM20 ou K4M, Epon é superior em propriedades de preservação e seccionamento de ultraestrutura. Anteriormente, demonstramos que o mEosEM pode sobreviver à fixação de tetróxido de ósmio e à incorporação de Epon. Usando o mEosEM, conseguimos, pela primeira vez, o Epon pós-incorporação CLEM, que mantém a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Aqui, fornecemos detalhes passo a passo sobre a preparação da amostra EM, a imagem FM, a imagem EM e o alinhamento da imagem. Também aprimoramos os procedimentos de identificação da mesma célula por imagem de FM durante a imagem de EM e detalhamos o registro entre as imagens de FM e EM. Acreditamos que se pode facilmente obter Epon pós-incorporação de microscopia correlativa de luz e eletrônica seguindo este novo protocolo em instalações tradicionais de EM.
Introduction
A microscopia de fluorescência (FM) pode ser usada para obter a localização e distribuição da proteína-alvo. No entanto, o contexto que envolve a proteína-alvo é perdido, o que é crucial para investigar a proteína alvo completamente. A microscopia eletrônica (ME) tem a mais alta resolução de imagem, fornecendo vários detalhes subcelulares. No entanto, a EM carece de rotulagem de alvo. Ao mesclar com precisão a imagem de fluorescência obtida por FM com a imagem cinza adquirida por EM, a microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM) pode combinar as informações obtidas por esses dois modos de imagem 1,2,3,4.
CLEM é um trade-off entre fluorescência e ultraestrutura1. Devido às limitações das proteínas fluorescentes atuais e aos procedimentos tradicionais de preparação de amostras de EM, especialmente o uso de ácido ósmico (OsO4) e resinas hidrofóbicas como o Epon, a ultraestrutura sempre compromete a fluorescência5. OsO4 é um reagente indispensável na preparação de amostras de EM, que é usado para melhorar o contraste de imagens EM. Comparado com outras resinas incorporadoras, o Epon é superior em propriedades de preservação e seccionamento ultraestrutural5. No entanto, nenhuma proteína fluorescente pode reter o sinal de fluorescência após o tratamento de OsO4 e incorporação de Epon6. Para superar as limitações das proteínas fluorescentes, foi desenvolvido o CLEM pré-incorporação, no qual a imagem de FM é feita antes do preparo da amostra deEM6. No entanto, a desvantagem da pré-incorporação do CLEM é o registro impreciso entre as imagens FM e EM5.
Ao contrário, o método CLEM pós-incorporação realiza a imagem de FM após o preparo da amostra EM, cuja precisão de registro pode chegar a 6-7 nm 5,6. Para reter a fluorescência das proteínas fluorescentes, concentrações muito baixas de OsO4 (0,001%)3 ou os métodos de preparação de EM4,7 congelados a alta pressão (HPF) e substituição por congelamento (FS)4,7 têm sido usados às custas do comprometimento da ultraestrutura ou do contraste da imagem EM. O desenvolvimento de mEos4b promove grandemente o progresso do CLEM pós-incorporação, embora o metacrilato de glicidila seja usado como resina de incorporação5. Com o desenvolvimento do mEosEM, que pode sobreviver à coloração OsO4 e à incorporação de Epon, a super-resolução CLEM pós-incorporação pós-Epon foi alcançada pela primeira vez, mantendo a fluorescência e a ultraestruturasimultaneamente6. Após o mEosEM, várias proteínas fluorescentes que podem sobreviver à coloração de OsO4 e à incorporação de Epon foram desenvolvidas 8,9,10,11. Isso promove muito o desenvolvimento do CLEM.
Há três aspectos fundamentais para o CLEM pós-incorporação do Epon. A primeira é a proteína fluorescente, que deve manter o sinal fluorescente após o preparo da amostra EM. De acordo com nossa experiência, mScarlet é superior a outras proteínas fluorescentes relatadas. A segunda é como encontrar a mesma célula fotografada por imagem FM em imagens EM. Para resolver esse problema, melhoramos o procedimento para essa etapa para que se possa encontrar prontamente a célula alvo. O último é o método para alinhar a imagem FM com a imagem EM. Aqui, detalhamos o registro entre as imagens FM e EM. Neste protocolo, expressamos mScarlet em neurônios VGLUT2 e demonstramos que mScarlet pode ter como alvo lisossomos secundários usando Epon pós-incorporação CLEM. Fornecemos detalhes passo a passo para o CLEM pós-incorporação da Epon, sem comprometer a fluorescência e a ultraestrutura.
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Protocol
A criação de animais e os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Fujian Medical University Medical Center. O fluxo de trabalho passo a passo do protocolo atual é mostrado na Figura 1.
1. Preparação da amostra
- Cérebro de camundongo
- Compre camundongos transgênicos (veja Tabela de Materiais) e primers de oligonucleotídeos (veja Tabela de Materiais) para genotipar esses camundongos.
- Perfundir e remover o cérebro íntegro da abóbada craniana seguindo protocolo previamente publicado12,13.
- Corrigir o cérebro do rato utilizando 10 ml de solução fixadora (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
- Enxaguar a solução fixadora por 3 x 10 min com tampão fosfato 0,1 M (PB).
- Corte o cérebro de camundongos em seções com 500 μm de espessura usando um micrótomo oscilante (ver Tabela de Materiais).
- Corte as regiões fluorescentes em pequenos blocos com bisturi usando um estereomicroscópio (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O volume dos pequenos blocos não deve ser superior a 1 mm3.
- Células cultivadas
- Semar células HeLa em placas de cultura celular de 6 cm e mantê-las em meio de crescimento (meio Dulbecco modificado de Eagle [DMEM] com baixa glicose, suplementado com 10% de soro fetal bovino [SFB]).
- No dia seguinte, transfecte os plasmídeos contendo mScarlet em células usando o reagente de transfecção de DNA (ver Tabela de Materiais) seguindo o livro de instruções do kit de transfecção.
- Quarenta e oito horas após a transfecção, tripsinizar as células transfectadas e centrifuga-las para obter pellets celulares a 1.000 × g. Os pellets de células são chamados de blocos de amostra.
2. Preparação da amostra de EM
- Fixação
- Fixar os blocos de amostra utilizando uma solução fixadora (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
- Remova a solução fixadora e lave a solução fixadora por 3 x 10 min com 0,1 M PB dos blocos de amostra.
- Coloração por tetróxido de ósmio (OsO4)
- Fixar os blocos de amostra com solução de OsO4 (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante 1 h.
- Retire a solução de OsO4 e lave a solução de OsO4 3 x 10 min com ddH2O dos blocos de amostra.
- Coloração com acetato de uranila (UA)
- Manchar os blocos de amostra utilizando uma solução de ácido úrico a 2% (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante 1 h.
- Retire a solução de ácido úrico e lave os blocos de amostra com ddH2O durante 3 x 10 min.
- Desidratação gradiente
- Desidratar os blocos de amostra com etanol gradiente da seguinte forma: 50% por 10 min, 70% por 10 min, 80% por 10 min, 90% por 10 min e 2 x 10 min em etanol 100%.
- Desidratar os blocos de amostra com acetona anidra por 3 x 10 min.
- Infiltração de resina
- Infiltrar-se nos blocos de amostra com resina gradiente (ver Tabela de Materiais): acetona para resina 3:1 por 1 h, acetona para resina 1:1 por 2 h, acetona para resina 1:3 por 3 h.
- Substitua pela resina pura por 3 x 12 h.
- Incorporação de resina
- Transfira blocos de amostra em cápsulas (consulte Tabela de Materiais) usando um palito.
- Adicionar a resina pura à cápsula que contém o bloco de amostra e polimerizar a resina no forno a 60 °C durante 14-16 horas.
3. Revestimento do vidro da cobertura com nanopartículas de ouro
- Limpeza de vidros de cobertura
- Lave os óculos de cobertura com tampão de limpeza (ver Tabela de Materiais) durante 2 h a 142 °C.
- Enxágue o tampão de limpeza 3 x 10 min com ddH2O.
- Transfira cuidadosamente as coberturas para um copo contendo álcool etílico anidro e incube durante a noite.
- Seque ao ar os óculos de cobertura em uma bancada limpa por vários minutos.
- Revestir os óculos de cobertura com nanopartículas de ouro.
- Fixe uma lâmina de vidro no centro da rotação de uma centrífuga de mesa (consulte Tabela de Materiais) usando cimento de vidro.
- Monte uma tampa no centro da lâmina de vidro usando notas adesivas.
- Adicionar 75 μL de pioloforme a 1% (ver Tabela de Materiais) ao vidro de cobertura.
NOTA: Também testamos o Formvar (consulte Tabela de Materiais) e ele funciona bem. - Gire por 3 min a 1.360 × g (Figura 2A) para produzir uma fina camada de pioloforme na superfície do vidro de cobertura.
- Incubar a superfície de vidro de cobertura com 250 μL de poli-L-lisina a 0,1% (ver Tabela de Materiais) durante 1 h à temperatura ambiente (Figura 2B).
- Enxágue com ddH2O e seque ao ar o vidro da tampa por vários minutos.
- Diluir nanopartículas de ouro de 80 nm (ver Tabela de Materiais) com ddH2O a 25% (v/v, OD600 = 0,07) (ver Tabela de Materiais) e sonicar por 15 min.
- Incubar a superfície de vidro de cobertura com as nanopartículas de ouro diluídas por 1 h à temperatura ambiente (Figura 2C).
- Enxágue com ddH2O e seque ao ar o vidro da tampa por vários minutos.
NOTA: Funciona bem 2 semanas após ser revestido com pioloformes e nanopartículas de ouro. Mas recomendamos usá-lo imediatamente após ser revestido.
4. Seccionamento ultrafino
- Aparar a superfície do bloco de amostra em um trapézio de ângulo reto. Corte secções a uma espessura de 100 nm utilizando uma faca de diamante (ver Tabela de Materiais) com um ultramicrótomo (ver Tabela de Materiais). Separe uma única seção da faixa de seção e flutue a única seção no banho-maria.
- Adicione uma gota de ddH2O no centro do vidro revestido com nanopartículas de ouro. Pegue uma seção usando um loop de amostra e inverta o loop de amostra na superfície da gota de água. Remova o laço de amostra, deixando a seção na superfície da gota de água.
- Seque ao ar o vidro da tampa por vários minutos. Desenhe um anel ao redor da seção no lado oposto da tampa usando uma caneta marcadora.
5. Imagem por microscopia óptica
- Recuperação de fluorescência
NOTA: O fluxo de trabalho é mostrado na Figura 3A.- Adicione 10 μL de tampão de montagem (ver Tabela de Materiais) na seção ultrafina do vidro da tampa. Coloque uma nova tampa limpa no tampão de montagem.
NOTA: O componente chave do buffer de montagem é DABCO, que é usado para recuperar a fluorescência de proteínas fluorescentes. Isso é muito importante para a recuperação da fluorescência. - Coloque esses dois óculos de cobertura junto com a seção ultrafina em uma câmara de imagem (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que o vidro de cobertura com o anel desenhado está na parte superior.
- Adicione 10 μL de tampão de montagem (ver Tabela de Materiais) na seção ultrafina do vidro da tampa. Coloque uma nova tampa limpa no tampão de montagem.
- Colete o mapa de navegação.
- Encontre a seção usando o anel desenhado como marcador no modo de imagem de campo claro de um microscópio de fluorescência invertida (consulte Tabela de Materiais). Mover para um canto da seção. Acenda a luz branca e tire a imagem de campo brilhante.
- Desligue a luz branca. Ligue o laser (561 nm) e tire imagens fluorescentes do mesmo campo de visão (FOV).
- Desligue o laser. Mova para o FOV adjacente, certificando-se de que esses dois FOVs tenham uma sobreposição de 10%. Pegue a imagem de campo brilhante e a imagem fluorescente do segundo FOV.
- Repita essa operação até que toda a seção esteja coberta. Registre o caminho de imagem que pode ser usado para costurar o FOV.
NOTA: Para maior qualidade da imagem, recomendamos o uso do microscópio confocal.
- Células de imagem de interesse.
- Use o mapa de navegação para segmentar facilmente as células de interesse. Ligue o laser (561 nm) e tire 300 quadros de imagens fluorescentes da célula de interesse. Desligue o laser.
- Acenda a luz branca e tire imagens de campo brilhante sequenciais (~100 quadros).
- Mover para outra célula de interesse.
6. Preparação para imagens EM
NOTA: O fluxo de trabalho é mostrado na Figura 3B.
- Transfira a seção ultrafina para a grade de slots.
- Encha um frasco de vidro com ddH2O.
- Retire os óculos da câmara e separe os dois copos com uma pinça. Aperte o vidro da tampa em que a seção está localizada, lave o tampão de montagem e seque ao ar.
- Marcar um # ao redor da seção ultrafina usando uma lâmina unilateral e soltar 10 μL de ácido fluorídrico a 12% (ver Tabela de Materiais) em cada canto do #. Coloque o vidro de cobertura lentamente na água.
NOTA: O ácido fluorídrico reage com o vidro, facilitando a remoção da película pioloforme do vidro da tampa. O ácido fluorídrico é tóxico. Use-o em um capuz químico com luvas. O contato com a pele requer atenção médica imediata. - Flutue o filme pioloforme e a seção ultrafina na superfície da água juntos. Coloque uma grade de slot não revestida na seção para capturar a seção no centro da grade.
- Cubra uma lâmina de vidro com parafilme (consulte Tabela de Materiais) e pegue a grade com o filme pioloforme. Seque a grade à temperatura ambiente.
- Coloração de seção
- Manchar a seção com 2% de UA e a vantagem tripla de Sato. Para mais detalhes, consulte o protocolo2 publicado anteriormente.
7. Análise das imagens
- Costurar o mapa de navegação.
- Encontre o local dos dados brutos. Abra o software ImageJ (consulte Tabela de Materiais) para costurar o mapa de navegação.
- Clique em Plugins | Costura | Costura de grade/coleção | (Tipo) Grade: cobra por coluna | (Encomendar) Up & Left (de acordo com a sequência de disparo) | Definir tamanho da fatia | Selecionar caminho de dados | Definir nome do arquivo | Verifique a fusão de exibição. Observe o resultado, que é um mapa de navegação composto por várias imagens de campo brilhante de diferentes FOVs.
- Use o mesmo método para costurar um mapa de navegação de fluorescência.
- Mescle as imagens de campo brilhante com as imagens de fluorescência.
- No software ImageJ, clique em Arquivo | Importação | Sequência de imagens para importar as imagens de campo brilhante sequenciais da célula de interesse.
- Clique na Imagem | Pilhas | Projeção Z | Soma Fatias para obter a imagem de projeção de intensidade de soma (SIP) das imagens de campo brilhante sequenciais.
- Clique em Editar | Inverter para inverter a imagem SIP do campo brilhante para que os sinais das nanopartículas de ouro se tornem pontos brancos brilhantes.
- No ImageJ, clique em Arquivo | Importação | Sequência de imagens para importar as imagens FM sequenciais.
- Clique na Imagem | Pilhas | Projeção Z | Soma fatias para obter a imagem SIP das imagens FM sequenciais.
- Clique na Imagem | Cor | Mesclar canais para mesclar a imagem de campo brilhante SIP com a imagem SIP FM como uma imagem composta.
- As nanopartículas de ouro são verdes e a proteína fluorescente é vermelha. Clique na Imagem | Tipo | Cor RGB para converter o formato da imagem composta em RGB.
8. Imagem EM
- Coloque a grade no porão de amostra, mantendo o lado da seção da grade para cima.
- Use o mapa de navegação para identificar aproximadamente a posição das células correspondentes sob um microscópio eletrônico através de quatro distâncias relativas aos quatro cantos diferentes do trapézio direito da seção ultrafina.
- Confirme as células usando as nanopartículas de ouro.
- Tire imagens EM em diferentes ampliações (4.200x, 6.000x ou 8.200x) com um microscópio eletrônico de transmissão (MET) (consulte Tabela de Materiais).
9. Registro da imagem FM com a imagem EM
- Abra o software de registro (consulte a Tabela de Materiais). Digite easyCLEMv014na janela de pesquisa. Clique em easyCLEMv0 para abrir easyCLEMv0. Clique em Imagem/Sequência | Abra para importar a imagem EM e a imagem composta para o painel do software.
- Na janela EasyCLEMv0, clique em 2D (x,y,[T]) para escolher não rígido (2D ou 3D) como modo de alinhamento.
- Na janela EasyCLEMv0, clique na caixa suspensa à direita de Selecionar imagem que será transformada e redimensionada (provavelmente FM) para escolher Composto (RGB)color.tif. Em seguida, clique na caixa suspensa à direita de Selecionar imagem que não será modificada (provavelmente EM) para escolher EMimage. tif.
- Clique em Iniciar para iniciar o cadastro.
- Na janela de imagem EM chamada EMimage. tif, clique em uma nanopartícula de ouro para colocar o Ponto 1 na nanopartícula de ouro. Na janela de imagem FM chamada Composite (RGB)color.tif, clique na nanopartícula de ouro correspondente para colocar o Ponto 1 na nanopartícula de ouro.
- Clique em Update Transformation para confirmar o sinal LM com o sinal EM das nanopartículas de ouro.
- Repita a operação acima na janela de imagem EM chamada EMimage. tif e combine o sinal LM com o sinal EM da mesma nanopartícula de ouro, um por um.
- Clique em Parar para concluir o registro.
- Após o alinhamento da imagem, clique em Imagem sobreposta e clique em Imagem/Sequência | Salvar como para exportar uma pilha de imagens contendo imagens de quatro canais (vermelho, verde, azul, cinza).
- Abra o ImageJ e clique em Arquivo | Abra para importar a imagem sobreposta . Clique na Imagem | Pilhas | Empilhar em imagens para separar a imagem sobreposta em imagens de quatro canais.
- Clique na Imagem | Cor | Mesclar canais para mesclar imagens de três canais (vermelho, verde e cinza) em uma imagem composta.
- Clique na Imagem | Tipo | Cor RGB para converter a imagem composta em uma imagem CLEM.
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Representative Results
Relatos anteriores demonstraram que o mScarlet pode atingir o lisossomo15. Neste protocolo, AAV expressando mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) foi injetado no M1 (ML: ±1,2 AP: +1,3 DV: -1,5) do cérebro de camundongos Vglut2-ires-cre usando instrumentos estereotáxicos. Seguindo o protocolo descrito acima, a imagem final correlacionada é mostrada na Figura 4A. A imagem FM pode ser alinhada com precisão com a imagem EM usando nanopartículas de ouro (os pontos verdes) como marcadores fiduciais. Como mostrado na imagem EM (Figura 4C,F), o mScarlet teve como alvo o lisossomo, e o conteúdo dentro dos lisossomos é heterogêneo, que são as características típicas do lisossomo secundário.
Figura 1: Visão geral esquemática da microscopia correlativa de luz e eletrônica. (A) Preparação do cérebro de camundongos. Vírus adenoassociados foram injetados no cérebro de camundongos. Após 30 dias, as regiões fluorescentes de fatias cerebrais de camundongos foram cortadas em pequenos blocos para a preparação da amostra de EM. (B) Preparação da amostra EM. (C) Secção ultrafina com uma faca diamantada e o diagrama esquemático do vidro de cobertura. (D) Imagem de FM e TEM. Abreviações: EM = microscopia eletrônica; FM = microscopia de fluorescência; TEM = microscopia eletrônica de transmissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Revestimento de vidros com nanopartículas de ouro. (A) Cobrir o vidro de cobertura com pioloforme por centrifugação. (B) Incubar a superfície de vidro com poli-L-lisina. (C) Incubar a superfície de vidro de cobertura com as nanopartículas de ouro diluídas. (D) Diagrama esquemático do vidro revestido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cronograma dos preparativos para imagens de FM e imagens de EM. (A) O fluxo de trabalho dos preparativos para imagens de FM consiste em cinco etapas: (i) colher a seção ultrafina, (ii) secagem ao ar, (iii) colocar uma segunda tampa de vidro após adicionar o tampão, (iv) fixar ambos os óculos de cobertura na câmara e imagem de FM. (B) O fluxo de trabalho dos preparativos para a aquisição de imagens EM também consiste em cinco etapas: (i) separar os dois óculos de cobertura, (ii) flutuar a seção ultrafina, (iii) colher a seção ultrafina, (iv) mover a seção ultrafina para a grade de slot e (v) imagem EM. Abreviações: EM = microscopia eletrônica; FM = microscopia de fluorescência; TEM = microscopia eletrônica de transmissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem CLEM representativa do mScarlet. (A) A imagem CLEM de todo o neurônio. (B,E) As imagens CLEM do inset. (C,F) As imagens EM do inset. (D,G) As imagens de fluorescência do inset. Pontos verdes indicam nanopartículas de ouro. Barra de escala = 5 μm (A), 1 μm (imagens inseridas). Abreviações: EM = microscopia eletrônica; FM = microscopia de fluorescência; CLEM = microscopia correlativa de luz e eletrônica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado é um método de imagem versátil, que pode combinar as informações de localização da proteína-alvo da microscopia de luz (LM) e o contexto em torno da proteína-alvo da microscopia eletrônica (ME)6. Com as limitações das proteínas fluorescentes atuais, o método amplamente utilizado é a pré-incorporação de microscopia eletrônica e de luz correlativa (CLEM), o que significa que a imagem de LM é feita antes da preparação da amostra EM. Quase todas as proteínas fluorescentes existentes podem ser examinadas na pré-incorporação do CLEM. No entanto, devido às inevitáveis distorções e encolhimentos, o alinhamento preciso da imagem final é impossível6. Portanto, a informação fornecida pela pré-incorporação CLEM é verificar as ultraestruturas da mesma célula imageadas por LM em imagens EM.
O método fornecido por este estudo é o CLEM pós-incorporação, no qual a imagem de ML é feita após o preparo da amostra de EM. A retração causada pela fixação química na preparação da amostra de EM não afeta o alinhamento preciso da imagem final. Além disso, como tanto a imagem LM quanto a imagem EM são feitas na mesma seção e com a ajuda de nanopartículas de ouro, o alinhamento final da imagem pode ser muito preciso. O CLEM pós-incorporação requer que as proteínas fluorescentes retenham um sinal fluorescente após a preparação convencional da amostra EM. Anteriormente, havíamos relatado a primeira proteína fluorescente chamada mEosEM, que pode reter sinais fluorescentes usando Epon como resina de incorporação8. Em comparação com outras resinas como resinas de incorporação, Epon tem propriedades superiores de preservação e seccionamento da ultraestrutura. Após o mEosEM, outras proteínas fluorescentes resistentes incorporadas ao Epon foram relatadas, como mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi 10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 e HfYFP9.
De acordo com nossa experiência, mScarlet é superior a outras proteínas fluorescentes. A solução fixadora pode afetar a fluorescência de proteínas fluorescentes. Em geral, a velocidade de fixação do paraformaldeído (PFA) é muito mais lenta que a do glutaraldeído (GA); por outro lado, o PFA penetra na amostra mais rapidamente do que o AG maior. Uma mistura de PFA e GA fornece um equilíbrio entre a fixação da amostra com rapidez suficiente para que sua qualidade seja mantida, mas lentamente o suficiente para que danos à amostra, como oxidação, não ocorram. Quanto maior a concentração de GA, maior a autofluorescência. Pela nossa experiência, a fluorescência do mScarlet em bloco de resina pode ser detectada 6 meses após a polimerização. Mas recomendamos fazer imagens CLEM imediatamente após a polimerização.
Outro fator fundamental na pós-incorporação do CLEM é como registrar a imagem LM com a imagem EM com precisão. Com base em métodos previamenterelatados6,21, foram feitas algumas modificações no protocolo. A primeira é como encontrar a mesma célula fotografada por LM em imagens EM. Pegamos diferentes FOVs para costurar o mapa de navegação de toda a seção ultrafina usando DIC e modo de imagem de fluorescência. Usando o mapa de navegação, as células de interesse puderam ser facilmente identificadas. Outra melhoria é o alinhamento preciso da imagem. Anteriormente, utilizamos o sinal fluorescente no modo de imagem de fluorescência e um sinal de alto contraste eletrônico no modo de imagem EM das nanopartículas de ouro como marcadores de alinhamento fiducial6. No entanto, ao usar mScarlet, o sinal fluorescente de mScarlet foi muito maior do que o sinal fluorescente das nanopartículas de ouro e foi difícil detectar o sinal fluorescente de nanopartículas de ouro. Para resolver este problema, usamos o sinal de campo brilhante das nanopartículas de ouro para registro em vez do sinal fluorescente. Seguindo esse protocolo modificado, foi fácil realizar CLEM pós-incorporação.
No entanto, existem algumas limitações do protocolo atual, que devem ser levadas em consideração antes de utilizá-lo. Embora funcione bem no sistema de superexpressão, a fluorescência é bastante tênue se as proteínas-alvo estiverem sob seu promotor nativo22. Outra limitação é que, embora a mScarlet seja a melhor proteína fluorescente (de acordo com nossa experiência) que pode reter sinais de fluorescência suficientes após a preparação da amostra de EM e funciona bem em células de mamíferos, será um problema ao usar a mScarlet como uma etiqueta fluorescente em neurônios, o que pode levar à localização equivocada das proteínas-alvo15. Nesses casos, sugerimos o uso do oScarlet15, uma mutação do mScarlet, que funciona bem em neurônios.
As potenciais aplicações deste protocolo modificado podem ser divididas em duas categorias. A primeira é ampliar o nível subcelular, o que significa estudar a proteína-alvo no contexto subcelular. Em nossos relatos publicados anteriormente, usamos CLEM pós-incorporação para examinar a formação de compartimentos de montagem de viriões citoplasmáticos (cVACs) durante a infecção por um γ-herpesvírus23. Em aplicações futuras, o CLEM pós-incorporação pode ser combinado com a tomografia eletrônica para obter a distribuição 3D das proteínas-alvo e resolver a estrutura 3Dnativamente24. O segundo tipo de aplicação potencial é reduzir o zoom para o nível celular, que pode ser usado para desenhar e analisar circuitos neurais. Devido à sua capacidade de alta resolução, o EM tornou-se um meio eficaz de mapear conexões cerebrais finas. No entanto, a EM não pode fornecer com precisão as identidades dos neurônios, o que limita a análise aprofundada do circuito neuronal. Epon pós-incorporação CLEM tem o potencial de trazer as identidades dos neurônios para o circuito neuronal sem comprometer as ultraestruturas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este projeto foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32201235 a Zhifei Fu), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (2022J01287 a Zhifei Fu), a Fundação de Pesquisa para Talentos Avançados da Universidade Médica de Fujian, China (XRCZX2021013 a Zhifei Fu), a Fundação de Ciências Especiais de Finanças da Província de Fujian, China (22SCZZX002 a Zhifei Fu), Fundação do NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, e Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 para Zhifei Fu). Agradecemos a Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin e Yan Hu no Centro de Serviços de Tecnologia Pública, Fujian Medical University pelo apoio com a preparação de amostras EM e imagens EM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
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