Summary
Nous présentons un protocole détaillé pour la microscopie corrélative à la lumière et à la lumière électronique post-intégration d’Epon en utilisant une protéine fluorescente appelée mScarlet. Cette méthode permet de maintenir simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Cette technique se prête à une grande variété d’applications biologiques.
Abstract
La microscopie corrélative à la lumière et aux électrons (CLEM) est une microscopie complète qui combine les informations de localisation fournies par la microscopie à fluorescence (FM) et le contexte de l’ultrastructure cellulaire acquise par microscopie électronique (EM). CLEM est un compromis entre la fluorescence et l’ultrastructure, et généralement, l’ultrastructure compromet la fluorescence. Comparé à d’autres résines d’enrobage hydrophiles, telles que le méthacrylate de glycidyle, HM20 ou K4M, Epon est supérieur en termes de propriétés de préservation des ultrastructures et de sectionnement. Auparavant, nous avions démontré que mEosEM peut survivre à la fixation au tétroxyde d’osmium et à l’intégration d’Epon. En utilisant mEosEM, nous avons obtenu, pour la première fois, Epon post embedded CLEM, qui maintient simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Ici, nous fournissons des détails étape par étape sur la préparation de l’échantillon EM, l’imagerie FM, l’imagerie EM et l’alignement de l’image. Nous améliorons également les procédures d’identification de la même cellule imagée par imagerie FM pendant l’imagerie EM et détaillons l’alignement entre les images FM et EM. Nous pensons que l’on peut facilement réaliser la microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon en suivant ce nouveau protocole dans les installations EM traditionnelles.
Introduction
La microscopie à fluorescence (FM) peut être utilisée pour obtenir la localisation et la distribution de la protéine cible. Cependant, le contexte qui entoure la protéine cible est perdu, ce qui est crucial pour étudier la protéine cible de manière approfondie. La microscopie électronique (EM) a la résolution d’imagerie la plus élevée, fournissant plusieurs détails subcellulaires. Néanmoins, EM manque d’étiquetage cible. En fusionnant avec précision l’image de fluorescence prise par FM avec l’image grise acquise par EM, la microscopie corrélative et électronique (CLEM) peut combiner les informations obtenues par ces deux modes d’imagerie 1,2,3,4.
CLEM est un compromis entre la fluorescence et l’ultrastructure1. En raison des limites des protéines fluorescentes actuelles et des procédures traditionnelles de préparation des échantillons EM, en particulier l’utilisation d’acide osmique (OsO4) et de résines hydrophobes telles que l’Epon, l’ultrastructure compromet toujours la fluorescence5. OsO4 est un réactif indispensable dans la préparation des échantillons EM, qui est utilisé pour améliorer le contraste des images EM. Comparé à d’autres résines d’enrobage, Epon est supérieur en termes de propriétés de conservation et de coupe des ultrastructures5. Cependant, aucune protéine fluorescente ne peut retenir le signal de fluorescence après le traitement d’OsO4 et d’Epon embedding6. Pour surmonter les limites des protéines fluorescentes, le CLEM de pré-intégration a été développé, dans lequel l’imagerie FM est effectuée avant la préparation de l’échantillon EM6. Cependant, l’inconvénient du CLEM pré-intégré est le recalage imprécis entre les images FM et EM5.
Au contraire, la méthode CLEM post-intégration effectue l’imagerie FM après la préparation de l’échantillon EM, dont la précision de repérage peut atteindre 6-7 nm 5,6. Pour conserver la fluorescence des protéines fluorescentes, de très faibles concentrations d’OsO4 (0,001 %)3 ou les méthodes de préparation EM congelées à haute pression (HPF) et de substitution par congélation (FS) 4,7 ont été utilisées au détriment de l’ultrastructure compromise ou du contraste de l’image EM. Le développement de mEos4b favorise grandement les progrès de CLEM post-intégration, bien que le méthacrylate de glycidyle soit utilisé comme résine d’enrobage5. Avec le développement de mEosEM, qui peut survivre à la coloration OsO4 et à l’enrobage d’Epon, le CLEM de super-encastrement post-enrobage d’Epon a été réalisé pour la première fois, en maintenant la fluorescence et l’ultrastructure simultanément6. Après mEosEM, plusieurs protéines fluorescentes capables de survivre à la coloration OsO4 et à l’enrobage d’Epon ont été développées 8,9,10,11. Cela favorise grandement le développement de CLEM.
Il y a trois aspects clés à Epon post-intégration CLEM. La première est la protéine fluorescente, qui doit maintenir le signal fluorescent après la préparation de l’échantillon EM. D’après notre expérience, mScarlet est supérieur aux autres protéines fluorescentes signalées. La seconde est de savoir comment trouver la même cellule imagée par imagerie FM en imagerie EM. Pour résoudre ce problème, nous améliorons la procédure de cette étape afin que l’on puisse facilement trouver la cellule ciblée. La dernière est la méthode pour aligner l’image FM avec l’image EM. Ici, nous détaillons le recalage entre les images FM et EM. Dans ce protocole, nous exprimons mScarlet dans les neurones VGLUT2 et démontrons que mScarlet peut cibler les lysosomes secondaires en utilisant le CLEM post-intégration d’Epon. Nous fournissons des détails étape par étape pour le CLEM post-enrobage Epon, sans compromettre la fluorescence et l’ultrastructure.
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Protocol
L’élevage et les expériences ont été approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université médicale du Fujian. Le flux de travail étape par étape du protocole actuel est illustré à la figure 1.
1. Préparation des échantillons
- Cerveau de souris
- Achetez des souris transgéniques (voir le tableau des matériaux) et des amorces oligonucléotidiques (voir le tableau des matériaux) pour génotyper ces souris.
- Perfuser et retirer le cerveau intact de la voûte crânienne en suivant le protocole12,13 précédemment publié.
- Fixez le cerveau de la souris à l’aide de 10 mL de solution fixatrice (voir le tableau des matières) à 4 °C pendant la nuit.
- Rincer la solution fixatrice pendant 3 x 10 min avec un tampon phosphate (PB) 0,1 M.
- Découper le cerveau de la souris en sections de 500 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome oscillant (voir Tableau des matériaux).
- Coupez les régions fluorescentes en petits blocs avec un scalpel à l’aide d’un stéréomicroscope (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Le volume des petits blocs ne doit pas être supérieur à 1 mm3.
- Cellules cultivées
- Semez les cellules HeLa dans des boîtes de culture cellulaire de 6 cm et maintenez-les dans un milieu de croissance (milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM] à faible teneur en glucose, complété par 10 % de sérum bovin fœtal [FBS]).
- Le lendemain, transfectez les plasmides contenant mScarlet dans des cellules à l’aide d’un réactif de transfection d’ADN (voir Tableau des matériaux) en suivant le manuel d’instructions du kit de transfection.
- Quarante-huit heures après la transfection, trypsiniser les cellules transfectées et les centrifuger pour obtenir des pastilles cellulaires à 1 000 × g. Les pastilles cellulaires sont appelées blocs d’échantillons.
2. Préparation des échantillons EM
- Fixation
- Fixez les blocs d’échantillons à l’aide d’une solution fixatrice (voir tableau des matériaux) à 4 °C pendant la nuit.
- Retirer la solution fixatrice et rincer la solution fixatrice pendant 3 x 10 min avec 0,1 M PB des blocs d’échantillons.
- Coloration au tétroxyde d’osmium (OsO4)
- Fixer les blocs d’échantillons avec la solution d’OsO4 (voir tableau des matériaux) à 4 °C pendant 1 h.
- Retirer la solution d’OsO4 et rincer la solution d’OsO4 3 x 10 min avec du ddH2O des blocs d’échantillons.
- Coloration à l’acétate d’uranyle (UA)
- Colorer les blocs d’échantillons avec une solution UA à 2 % (voir tableau des matériaux) à 4 °C pendant 1 h.
- Retirer la solution d’UA et rincer les blocs d’échantillons avec du ddH2O pendant 3 x 10 min.
- Déshydratation par gradient
- Déshydrater les blocs d’échantillons avec de l’éthanol à gradient comme suit : 50 % pendant 10 min, 70 % pendant 10 min, 80 % pendant 10 min, 90 % pendant 10 min et 2 x 10 min dans de l’éthanol à 100 %.
- Déshydrater les blocs d’échantillons avec de l’acétone anhydre pendant 3 x 10 min.
- Infiltration de résine
- Infiltrez les blocs d’échantillons avec de la résine à gradient (voir tableau des matériaux) : acétone à résine 3:1 pendant 1 h, acétone à résine 1:1 pendant 2 h, acétone à résine 1:3 pendant 3 h.
- Remplacer par la résine pure pendant 3 x 12 h.
- Enrobage de résine
- Transférez les blocs d’échantillons dans des capsules (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un cure-dent.
- Ajouter de la résine pure dans la capsule contenant le bloc d’échantillon et polymériser la résine au four à 60 °C pendant 14 à 16 h.
3. Revêtement du verre de protection avec des nanoparticules d’or
- Nettoyage des vitres
- Lavez les couvre-verres avec un tampon de nettoyage (voir tableau des matériaux) pendant 2 h à 142 °C.
- Rincer le tampon de nettoyage 3 x 10 min avec ddH2O.
- Transférez soigneusement les couvre-verres dans un bécher contenant de l’alcool éthylique anhydre et incubez pendant la nuit.
- Faites sécher les couvre-verres à l’air libre sur une paillasse propre pendant plusieurs minutes.
- Enduire les lunettes de protection de nanoparticules d’or.
- Fixez une lame de verre au centre de la rotation d’une centrifugeuse de bureau (voir Tableau des matériaux) à l’aide de ciment de verre.
- Montez un couvre-objet au centre de la lame de verre à l’aide de notes autocollantes.
- Ajouter 75 μL de pioloforme à 1 % (voir le tableau des matériaux) sur le couvre-viseur.
NOTE : Nous avons également testé Formvar (voir tableau des matériaux) et il fonctionne bien. - Essorer pendant 3 minutes à 1 360 × g (figure 2A) pour produire une fine couche de pioloforme à la surface du couvre-viseur.
- Incuber la surface du verre de protection avec 250 μL de poly-L-lysine à 0,1 % (voir le tableau des matériaux) pendant 1 h à température ambiante (figure 2B).
- Rincer avec du ddH2O et sécher à l’air libre pendant plusieurs minutes.
- Diluer 80 nm de nanoparticules d’or (voir Tableau des matériaux) avec du ddH2O à 25 % (v/v, OD600 = 0,07) (voir Tableau des matériaux) et soniser pendant 15 min.
- Incuber la surface du verre de couverture avec les nanoparticules d’or diluées pendant 1 h à température ambiante (figure 2C).
- Rincer avec du ddH2O et sécher à l’air libre pendant plusieurs minutes.
REMARQUE : Il fonctionne bien 2 semaines après avoir été recouvert de nanoparticules de pioloforme et d’or. Mais nous vous recommandons de l’utiliser immédiatement après avoir été enduit.
4. Coupe ultrafine
- Coupez la surface du bloc d’échantillon en un trapèze à angle droit. Couper des coupes à une épaisseur de 100 nm à l’aide d’un couteau diamanté (voir Tableau des matériaux) avec un ultramicrotome (voir Tableau des matériaux). Séparez une seule section de la bande de section et faites flotter la section unique dans le bain-marie.
- Ajoutez une goutte de ddH2O au centre du verre de protection recouvert de nanoparticules d’or. Prenez une section à l’aide d’une boucle d’échantillonnage et inversez la boucle d’échantillonnage sur la surface de la goutte d’eau. Retirez la boucle d’échantillonnage en laissant la section à la surface de la goutte d’eau.
- Séchez le couvre-objet à l’air libre pendant plusieurs minutes. Dessinez un anneau autour de la section du côté opposé du couvre-objet à l’aide d’un marqueur.
5. Imagerie par microscopie optique
- Récupération de fluorescence
REMARQUE : Le flux de travail est illustré à la figure 3A.- Ajoutez 10 μL de tampon de montage (voir tableau des matériaux) sur la section ultramince du verre de protection. Placez un nouveau couvre-objet propre sur le tampon de montage.
REMARQUE : Le composant clé du tampon de montage est le DABCO, qui est utilisé pour récupérer la fluorescence des protéines fluorescentes. Ceci est très important pour la récupération de la fluorescence. - Placez ces deux couvre-verres avec la section ultramince dans une chambre d’imagerie (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que le couvre-objet avec l’anneau dessiné est sur le dessus.
- Ajoutez 10 μL de tampon de montage (voir tableau des matériaux) sur la section ultramince du verre de protection. Placez un nouveau couvre-objet propre sur le tampon de montage.
- Récupérez la carte de navigation.
- Trouvez la coupe en utilisant l’anneau dessiné comme marqueur en mode d’imagerie en fond clair d’un microscope à fluorescence inversée (voir Tableau des matériaux). Déplacez-vous vers un coin de la section. Allumez la lumière blanche et prenez l’image en fond clair.
- Éteignez la lumière blanche. Allumez le laser (561 nm) et prenez des images fluorescentes du même champ de vision (FOV).
- Éteignez le laser. Déplacez-vous vers le champ de vision adjacent, en vous assurant que ces deux champs de vision se chevauchent à 10 %. Prenez l’image en fond clair et l’image fluorescente du deuxième FOV.
- Répétez cette opération jusqu’à ce que toute la section soit couverte. Enregistrez le chemin d’imagerie qui peut être utilisé pour assembler le FOV.
REMARQUE : Pour une meilleure qualité de l’image, nous vous recommandons d’utiliser le microscope confocal.
- Cellules d’images d’intérêt.
- Utilisez la carte de navigation pour cibler facilement les cellules d’intérêt. Allumez le laser (561 nm) et prenez 300 images fluorescentes de la cellule d’intérêt. Éteignez le laser.
- Allumez la lumière blanche et prenez des images séquentielles en fond clair (~100 images).
- Passez à une autre cellule d’intérêt.
6. Préparation à l’imagerie EM
REMARQUE : Le flux de travail est illustré à la figure 3B.
- Transférez la section ultramince sur la grille de fente.
- Remplissez un bocal en verre avec du ddH2O.
- Retirez les couvre-verres de la chambre et séparez-les des deux couvre-verres avec une pince à épiler. Fixez le couvre-objet sur lequel se trouve la section, lavez le tampon de montage et séchez à l’air.
- Marquez un # autour de la section ultramince à l’aide d’une lame unilatérale et déposez 10 μL d’acide fluorhydrique à 12 % (voir le tableau des matériaux) à chaque coin du #. Mettez lentement le couvre-objet dans l’eau.
REMARQUE : L’acide fluorhydrique réagit avec le verre, ce qui facilite le retrait du film pioloforme du verre de protection. L’acide fluorhydrique est toxique. Utilisez-le dans une cagoule chimique avec des gants. Le contact avec la peau nécessite des soins médicaux immédiats. - Faites flotter le film pioloforme et la section ultramince à la surface de l’eau ensemble. Placez une grille de fente non revêtue sur la section pour capturer la section au centre de la grille.
- Recouvrez une lame de verre de parafilm (voir tableau des matériaux) et prenez la grille avec le film pioloforme. Séchez la grille à l’air libre à température ambiante.
- Coloration de la section
- Tachez la section avec 2% d’UA et la triple avance de Sato. Pour plus de détails, voir le protocole2 publié précédemment.
7. Analyse d’images
- Assemblez la carte de navigation.
- Trouvez l’emplacement des données brutes. Ouvrez le logiciel ImageJ (voir Table des matériaux) pour assembler la carte de navigation.
- Cliquez sur Plugins | Couture | Coutures quadrillées/collection | (Type) Grille : serpent par colonne | (Ordonnance) Haut et gauche (selon la séquence de tournage) | Définir la taille de la tranche | Sélectionner le chemin d’accès aux données | Définir le nom du fichier | Cochez la case Fusion d’affichage. Observez le résultat, qui est une carte de navigation composée de plusieurs images en fond clair de différents champs de vision.
- Utilisez la même méthode pour assembler une carte de navigation par fluorescence.
- Fusionnez les images en fond clair avec les images de fluorescence.
- Dans le logiciel ImageJ, cliquez sur Fichier | Importation | Séquence d’images pour importer les images séquentielles en fond clair de la cellule d’intérêt.
- Cliquez sur l’image | Piles | Projection Z | Additionner les tranches pour obtenir l’image SIP (Sum Intensity Projection) des images séquentielles en fond clair.
- Cliquez sur Modifier | Inverser pour inverser l’image SIP du fond clair afin que les signaux des nanoparticules d’or deviennent des points blancs brillants.
- Dans ImageJ, cliquez sur Fichier | Importation | Séquence d’images pour importer les images FM séquentielles.
- Cliquez sur l’image | Piles | Projection Z | Additionnez les tranches pour obtenir l’image SIP des images FM séquentielles.
- Cliquez sur l’image | Couleur | Fusionner les canaux pour fusionner l’image en fond clair SIP avec l’image SIP FM en tant qu’image composite.
- Les nanoparticules d’or sont vertes et la protéine fluorescente est rouge. Cliquez sur l’image | Type | Couleur RVB pour convertir le format de l’image composite en RVB.
8. Imagerie EM
- Placez la grille sur la prise d’échantillon, en gardant le côté section de la grille vers le haut.
- Utilisez la carte de navigation pour identifier approximativement la position des cellules correspondantes au microscope électronique à travers quatre distances relatives aux quatre coins différents du trapèze droit de la section ultramince.
- Confirmez les cellules à l’aide des nanoparticules d’or.
- Prenez des images EM à différents grossissements (4 200x, 6 000x ou 8 200x) avec un microscope électronique à transmission (MET) (voir Tableau des matériaux).
9. Enregistrement de l’image FM avec l’image EM
- Ouvrez le logiciel d’enregistrement (voir Tableau des matériaux). Tapez easyCLEMv014dans la fenêtre de recherche. Cliquez sur easyCLEMv0 pour ouvrir easyCLEMv0. Cliquez sur Image/Séquence | Ouvre pour importer l’image EM et l’image composite dans le panneau du logiciel.
- Dans la fenêtre EasyCLEMv0, cliquez sur 2D (x,y,[T]) pour choisir non rigide (2D ou 3D) comme mode d’alignement.
- Dans la fenêtre EasyCLEMv0, cliquez sur la liste déroulante à droite de Sélectionner l’image qui sera transformée et redimensionnée (probablement FM) pour choisir Composite (RVB)color.tif. Ensuite, cliquez sur la liste déroulante à droite de Sélectionner l’image qui ne sera pas modifiée (probablement EM) pour choisir EMimage. tif.
- Cliquez sur Démarrer pour commencer l’inscription.
- Dans la fenêtre d’image EM nommée EMimage. tif, cliquez sur une nanoparticule d’or pour placer le point 1 sur la nanoparticule d’or. Dans la fenêtre d’image FM nommée Couleur composite (RVB).tif, cliquez sur la nanoparticule d’or correspondante pour placer le point 1 sur la nanoparticule d’or.
- Cliquez sur Mettre à jour la transformation pour confirmer le signal LM avec le signal EM des nanoparticules d’or.
- Répétez l’opération ci-dessus dans la fenêtre d’image EM nommée EMimage. tif et faites correspondre le signal LM avec le signal EM de la même nanoparticule d’or un par un.
- Cliquez sur Arrêter pour terminer l’inscription.
- Après l’alignement de l’image, cliquez sur Image superposée et cliquez sur Image/Séquence | Enregistrer sous pour exporter une pile d’images contenant quatre images de canaux (rouge, vert, bleu, gris).
- Ouvrez ImageJ et cliquez sur Fichier | Ouvrir pour importer l’image superposée . Cliquez sur l’image | Piles | Empiler sur les images pour séparer l’image superposée en quatre images de canal.
- Cliquez sur l’image | Couleur | Fusionner les canaux pour fusionner les images de trois canaux (rouge, vert et gris) en une image composite.
- Cliquez sur l’image | Type | Couleur RVB pour convertir l’image composite en image CLEM.
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Representative Results
Des rapports antérieurs ont démontré que mScarlet peut cibler le lysosome15. Dans ce protocole, mScarlet exprimant l’AAV (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) a été injecté dans le M1 (ML : ±1,2 AP : +1,3 DV : -1,5) du cerveau de souris Vglut2-ires-cre à l’aide d’instruments stéréotaxiques. En suivant le protocole décrit ci-dessus, l’image corrélée finale est présentée à la figure 4A. L’image FM peut être alignée avec précision avec l’image EM en utilisant des nanoparticules d’or (les points verts) comme repères. Comme le montre l’image EM (Figure 4C, F), mScarlet ciblait le lysosome, et le contenu à l’intérieur des lysosomes est hétérogène, ce qui est les caractéristiques typiques du lysosome secondaire.
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de la microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique. (A) Préparation du cerveau de la souris. Des virus adéno-associés ont été injectés dans le cerveau de la souris. Après 30 jours, les régions fluorescentes des tranches de cerveau de souris ont été coupées en petits blocs pour la préparation des échantillons EM. (B) Préparation d’échantillons EM. (C) Coupe ultramince à l’aide d’un couteau diamanté et du diagramme schématique du couvre-objet. (D) Imagerie FM et imagerie TEM. Abréviations : EM = microscopie électronique ; FM = microscopie à fluorescence ; MET = microscopie électronique à transmission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Revêtement des couvre-verres avec des nanoparticules d’or. (A) Couvrir le couvre-objet avec du pioloforme par centrifugation. (B) Incuber la surface du verre de protection avec de la poly-L-lysine. (C) Incuber la surface du couvre-objet avec les nanoparticules d’or diluées. (D) Schéma de principe du couvre-objet à revêtement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Calendrier des préparatifs pour l’imagerie FM et l’imagerie EM. (A) Le flux de travail des préparations pour l’imagerie FM comprend cinq étapes : (i) ramassage de la section ultramince, (ii) séchage à l’air, (iii) mise en place d’un deuxième couvre-objet après l’ajout du tampon, (iv) fixation des deux couvre-verres dans la chambre et imagerie FM. (B) Le flux de travail des préparatifs pour l’imagerie EM comprend également cinq étapes : (i) séparer les deux couvre-verres, (ii) faire flotter la section ultramince, (iii) ramasser la section ultramince, (iv) déplacer la section ultramince sur la grille de fente, et (v) imagerie EM. Abréviations : EM = microscopie électronique ; FM = microscopie à fluorescence ; MET = microscopie électronique à transmission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Image CLEM représentative de mScarlet. (A) L’image CLEM de l’ensemble du neurone. (B,E) Les images CLEM de l’encart. (C, F) Les images EM de l’encart. (D,G) Les images de fluorescence de l’encart. Les points verts indiquent des nanoparticules d’or. Barre d’échelle = 5 μm (A), 1 μm (images en médaillon). Abréviations : EM = microscopie électronique ; FM = microscopie à fluorescence ; CLEM = microscopie corrélative à la lumière et à l’électron. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole présenté ici est une méthode d’imagerie polyvalente, qui peut combiner les informations de localisation de la protéine cible par microscopie optique (LM) et le contexte entourant la protéine cible par microscopie électronique (EM)6. Avec les limites des protéines fluorescentes actuelles, la méthode largement utilisée est la microscopie corrélative à la lumière et à l’électronium (CLEM), ce qui signifie que l’imagerie LM est effectuée avant la préparation de l’échantillon EM. Presque toutes les protéines fluorescentes existantes peuvent être examinées dans CLEM avant l’intégration. Cependant, en raison des distorsions et des rétrécissements inévitables, un alignement précis de l’image finale est impossible6. Par conséquent, les informations fournies par le pré-intégration de CLEM permettent de vérifier les ultrastructures de la même cellule imagées par LM en imagerie EM.
La méthode fournie par cette étude est le CLEM post-intégration, dans lequel l’imagerie LM est effectuée après la préparation de l’échantillon EM. Le rétrécissement causé par la fixation chimique dans la préparation des échantillons EM n’affecte pas l’alignement précis de l’image finale. De plus, comme l’imagerie LM et l’imagerie EM sont effectuées sur la même section et à l’aide de nanoparticules d’or, l’alignement final de l’image peut être très précis. Le CLEM post-intégration exige que les protéines fluorescentes conservent un signal fluorescent après la préparation conventionnelle de l’échantillon EM. Auparavant, nous avions signalé la première protéine fluorescente appelée mEosEM, qui peut retenir les signaux fluorescents en utilisant Epon comme résined’intégration 8. Comparé à d’autres résines comme résines d’enrobage, Epon possède des propriétés supérieures de conservation et de coupe des ultrastructures. Après mEosEM, d’autres protéines fluorescentes résistantes à l’intégration d’Epon, telles que mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 et HfYFP 9.
D’après notre expérience, mScarlet est supérieur aux autres protéines fluorescentes. La solution fixatrice peut affecter la fluorescence des protéines fluorescentes. En général, la vitesse de fixation du paraformaldéhyde (PFA) est beaucoup plus lente que celle du glutaraldéhyde (GA) ; à l’inverse, le PFA pénètre plus rapidement dans l’échantillon que le plus gros GA. Un mélange de PFA et de GA permet de trouver un équilibre entre la fixation de l’échantillon assez rapidement pour que sa qualité soit maintenue, mais assez lentement pour éviter que l’échantillon ne soit endommagé par l’oxydation. La concentration plus élevée de GA produira une autofluorescence plus élevée. D’après notre expérience, la fluorescence de mScarlet en bloc de résine peut être détectée 6 mois après la polymérisation. Mais nous recommandons de faire l’imagerie CLEM immédiatement après la polymérisation.
Un autre facteur clé dans l’intégration post-intégration de CLEM est la façon d’enregistrer l’image LM avec l’image EM avec précision. Sur la base des méthodes 6,21 précédemment rapportées, nous avons apporté quelques modifications au protocole. La première est de savoir comment trouver la même cellule imagée par LM en imagerie EM. Nous avons pris différents FOV pour assembler la carte de navigation de toute la section ultramince en utilisant le mode DIC et imagerie par fluorescence. À l’aide de la carte de navigation, les cellules d’intérêt ont pu être facilement identifiées. Une autre amélioration est l’alignement précis de l’image. Auparavant, nous utilisions le signal fluorescent en mode imagerie de fluorescence et un signal à contraste électronique élevé en mode d’imagerie EM des nanoparticules d’or comme marqueurs d’alignement repères6. Cependant, lors de l’utilisation de mScarlet, le signal fluorescent de mScarlet était beaucoup plus élevé que le signal fluorescent des nanoparticules d’or et il était difficile de détecter le signal fluorescent des nanoparticules d’or. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé le signal en fond clair des nanoparticules d’or pour l’enregistrement au lieu du signal fluorescent. En suivant ce protocole modifié, il était facile d’effectuer CLEM après l’intégration.
Cependant, il existe certaines limites du protocole actuel, qui doivent être prises en considération avant de l’utiliser. Bien qu’elle fonctionne bien dans le système de surexpression, la fluorescence est assez faible si les protéines cibles sont sous leur promoteur natif22. Une autre limitation est que, bien que mScarlet soit la meilleure protéine fluorescente (selon notre expérience) qui peut retenir suffisamment de signaux de fluorescence après la préparation de l’échantillon EM et fonctionne bien dans les cellules de mammifères, ce sera un problème lors de l’utilisation de mScarlet comme marqueur fluorescent dans les neurones, ce qui peut conduire à la mauvaise localisation des protéines cibles15. Dans ces cas, nous suggérons d’utiliser oScarlet15, une mutation de mScarlet, qui fonctionne bien dans les neurones.
Les applications potentielles de ce protocole modifié peuvent être divisées en deux catégories. La première consiste à zoomer au niveau subcellulaire, ce qui signifie étudier la protéine cible dans le contexte subcellulaire. Dans nos rapports publiés précédemment, nous avons utilisé CLEM post-intégration pour examiner la formation de compartiments d’assemblage de virions cytoplasmiques (CVVc) lors de l’infection par un γ-herpèsvirus23. Dans les applications futures, le CLEM post-intégration peut être combiné à la tomographie électronique pour obtenir la distribution 3D des protéines cibles et résoudre la structure 3D nativement24. Le deuxième type d’application potentielle consiste à effectuer un zoom arrière au niveau cellulaire, qui peut être utilisé pour dessiner et analyser des circuits neuronaux. En raison de sa capacité de haute résolution, EM est devenu un moyen efficace de cartographier les connexions cérébrales fines. Cependant, l’EM ne peut pas fournir avec précision l’identité des neurones, ce qui limite l’analyse approfondie du circuit neuronal. Epon post-intégration CLEM a le potentiel d’amener les identités des neurones dans le circuit neuronal sans compromettre les ultrastructures.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32201235 à Zhifei Fu), la Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (2022J01287 à Zhifei Fu), la Fondation de recherche pour les talents avancés de l’Université médicale du Fujian, Chine (XRCZX2021013 à Zhifei Fu), la Fondation des sciences spéciales des finances de la province du Fujian, Chine (22SCZZX002 à Zhifei Fu), Fondation du laboratoire clé du NHC pour l’évaluation technique de la régulation de la fertilité chez les primates non humains et de l’hôpital de santé maternelle et infantile du Fujian (2022-NHP-04 à Zhifei Fu). Nous remercions Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin et Yan Hu du Centre de services technologiques publics de l’Université médicale du Fujian pour leur soutien dans la préparation des échantillons EM et l’imagerie EM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
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