Dissektion af Midgut fra en voksen Fly: En metode til at isolere fordøjelseskanalen

Overview

I denne video fremhæver vi en dissektion af den voksne Drosophila tarm og indsamling af midguts egnet til enkeltcelle dissociation og FACS for at isolere tarmstamceller.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Tauc et al.,isolere tarm stamceller fra voksne Drosophila Midguts af FACS at studere stamcelle adfærd under aldring, J. Vis. Exp. (2014).

BEMÆRK: Hvis denne protokol første gang bruges til at isolere ISC'er ved FAC-sortering, er følgende kontrolelementer obligatoriske for i første omgang at indstille FACS-parametrene korrekt: Dissocierede celler fra vild type (f.eks. w¹¹¹⁸) Drosophila-midguts uden Sytox. Dissocierede celler fra vilde celler (f.eks. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts med Sytox (se trin 3.6). Dissociated celler fra midguts af esg-Gal4,UAS-GFP flyve linje uden Sytox.

1. Forberedelse af opløsninger og retter til gut dissektion

1. Forbered 4-6 hætteglas, der hver indeholder 40 kvindelige fluer fra esg-Gal4,UAS-GFP flyve linje.
2. Fra en 10x PBS lageropløsning forberedes 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄· H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, juster pH til 7,4).
3. Der fremstilles en 3,5% agaroseopløsning i 1x PBS (3,5 g agarose af elektrophoresiskvalitet i 100 ml 1x PBS). Forbered dissektionsplader ved at hælde denne opløsning i petriskåle (diameter 8,5 cm) for at dække bunden. Agaroselaget forhindrer, at spidsen af tangen beskadiges under dissektionsproceduren. Når gelen er størknet, opbevares dissektionspladerne ved 4 °C.
4. Der fremstilles 300 ml 1x PBS + 1% BSA frisk før dissekering, og flasken anbringes på is eller ved 4 °C.
5. Tænd centrifuge og lad den køle af til 4 °C.
6. Flamme spidsen af 2 glas Pasteur pipetter til at udjævne kanterne.
7. Rengør to par pincet og et barberblad med 70% ethanol.
8. Placer fire til seks 1,5 ml mikrocentrifugerør til opsamling af dissekerede midguts på is.

2. Forberedelse af mave-tarmkanalen og dissektion af Midgut

1. Bedøve fluer fra et hætteglas (40 fluer) med CO₂ på en standard flyve seng, halshugge alle fluer ved hjælp af et barberblad og overføre dem til dissektion parabol. Hæld kold 1x PBS/1% BSA-opløsning i dissektionsskålen for at dække agarosegelen. Fluerne vil flyde.
2. Grib flyvelivet med et par pincet, mens du holder brystkassen med det andet par pincet. Adskil brystkassen fra maven. Tarmen vil være synlig, og foregut/afgrøden vil sandsynligvis stadig være forbundet med brystkassen.
3. Grib tarmen og træk den ud af brystkassen. For at udfolde tarmen skal du gribe afgrøden og trække tarmen lidt forreste væk fra maven.
4. Grib den bageste ende af maven med et par pincet og kanten af den forreste åbne kutikula med det andet par pincet. Pas på ikke at ødelægge det fremspringende tarmvæv. Træk den bageste ende væk for at bryde neglebåndet og fortsætte med at trække posteriorly meget forsigtigt, indtil hele tarmen er blevet trukket ud af bughulen. Afgrøden skal muligvis fjernes på forhånd, hvis den er for stor til at passe gennem kropshulen.
5. Fjern foregut, malpighian tubules, hindgut og æggestokke forlader den nøgne midgut.
6. Ved hjælp af en glas Pasteur pipette overføres partiet af dissekerede midguts til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der indeholder kold 1x PBS/1% BSA-opløsning, og hold røret på is. Prøverne skal behandles inden for 2 timer.
7. Når dissektionen af et helt parti er afsluttet, skylles dissektionsskålen med dobbelt destilleret vand for at vaske snavs tilovers. Begynd at dissekere den næste batch midguts (gentag trin 2.1-2.7). Disseker så mange batches som muligt inden for 2 timer, og fortsæt derefter til trin 3.1.

3. Fordøjelsen af tarmvævet til høst af celler til FAC-sortering

1. 1x PBS/1% BSA-opløsningen fjernes fra midguts og tilsættes 500 μl 0,5% Trypsin-EDTA-opløsning til hver prøve.
2. Vortex godt i 20 sek og inkubere prøverne ved blid vuggende / roterende ved 20 omdrejninger i minuttet ved stuetemperatur i 25-30 min.
3. Vortex igen efter ca 30 min og lad den intakte midgut væv synke til bunden af røret. Fjern forsigtigt de celler, der er i suspension med et flammet glas Pasteur pipette og filtrere dem gennem en 35 μm nylon mesh i en frisk 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
4. Cellerne drejes ned ved 100 x g i 5 min ved 4 °C. Bemærk, når du starter fordøje, en celle pellet måske ikke være synlig i starten, men vil blive synlig som væv fordøje skrider frem.
   1. Trypsinopløsningen overføres forsigtigt tilbage til det originale prøveglas, der indeholder det resterende intakte midgutvæv. Undgå at overføre for mange celler fra pellet.
   2. Ophæng forsigtigt cellepillen igen i 400 μl kold 1x PBS/1% BSA. Opbevar mikrocentrifugerørene, der indeholder de dissociated celler på is, og dæk rørene med aluminiumsfolie for at beskytte cellerne mod lys.
   3. Vortex Trypsin opløsningen indeholder de resterende intakte midgut væv igen og læg prøverne på rocker i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur.
5. Gentag trin 3.3 til 3.4.3, indtil alt midgutvævet er fordøjet. Kombiner de dissociated celler fra alle mikrocentrifuge rør i en mikrocentrifuge rør. Dette kan kræve et centrifugeringstrin som i 3.4, da mængden af alle celleaffjedringer tilsammen kan overstige 1,5 ml. Hold celleaffjedringen på is og beskyt cellerne mod lys.
6. De adskilte celler drejes ned ved 100 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern forsigtigt så meget af supernatanten som muligt, så der efterlades ca. 50-100 μl af 1x PBS/1% BSA-opløsningen i mikrocentrifugerøret. Resuspend forsigtigt de dissociated celler i 800 μl 1x PBS/1% BSA indeholder Sytox (1:20,000).
7. Celleaffjedringen overføres til et 5 ml rundt Falcon-rør i bunden ved at filtrere cellerne gennem en fastgørelseshætte for cellesien (35 μm nylonnet). Opbevar altid celleprøver på is og beskyttet mod lys. Cellerne er nu klar til at blive sorteret.
8. Pipetter 600 μl RNAlateropløsning i hvert mikrocentrifugerør, hvori cellerne sorteres for efterfølgende RNA-isolering. Til andre downstream-applikationer kan cellerne opsamles i en anden opløsning, f.eks. i steril PBS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting