Disseksjon av midgut fra en voksen flue: En metode for å isolere fordøyelseskanalen

Overview

I denne videoen fremhever vi en disseksjon av den voksne Drosophila-tarmen og samlingen av midguts egnet for encellet dissosiasjon og FACS for å isolere tarmstammeceller.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Tauc et al.,Isolere tarmstammeceller fra voksen drosophila midguts av FACS for å studere stamcelleadferd under aldring, J. Vis. Exp. (2014).

MERK: Hvis denne protokollen brukes for første gang til å isolere ISCer ved hjelp av FAC-sortering, er følgende kontroller obligatoriske for først å angi FACS-parameterne riktig: Dissosierte celler fra villtype (f.eks. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts uten Sytox. Dissosierte celler fra vill type (f.eks. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts med Sytox (se trinn 3.6). Dissosierte celler fra midguts av esg-Gal4, UAS-GFP fly linje uten Sytox.

1. Tilberedning av løsninger og retter for tarm disseksjon

1. Forbered 4-6 hetteglass som hver inneholder 40 kvinnelige fluer fra esg-Gal4, UAS-GFP flylinje.
2. Fra en 10x PBS lagerløsning lag 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄· H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, juster pH til 7,4).
3. Forbered en 3,5% agarose løsning i 1x PBS (3,5 g elektroforese klasse agarose i 100 ml 1x PBS). Forbered disseksjonsplater ved å helle denne løsningen i petriskåler (diameter 8,5 cm) for å dekke bunnen. Det agarose laget forhindrer skade spissene på tang under disseksjonsprosedyren. Etter at gelen har størknet, oppbevar disseksjonsplatene ved 4 °C.
4. Forbered 300 ml 1x PBS + 1% BSA frisk før dissekering og legg flasken på is eller ved 4 °C.
5. Slå på sentrifuge og la den avkjøles til 4 °C.
6. Flamme spissene på 2 glass Pasteur pipetter for å glatte kantene.
7. Rengjør to par tang og ett barberblad med 70% etanol.
8. Plasser fire til seks 1,5 ml mikrocentrifugerør for innsamling av dissekerte midguts på is.

2. Fremstilling av mage-tarmkanalen og disseksjon av Midgut

1. Bedøve fluer fra ett hetteglass (40 fluer) med CO₂ på en standard flyseng, halshugge alle fluer ved hjelp av et barberblad og overføre dem til disseksjonsfatet. Hell kald 1x PBS/1% BSA-oppløsning i disseksjonsfatet for å dekke agarosegelen. Fluene vil flyte.
2. Ta tak i flylivet med ett par tang, mens du holder thoraxen med det andre par tang. Skill thoraxen fra magen. Tarmen vil være synlig og foregut / avlingen vil mest sannsynlig fortsatt være koblet til thoraxen.
3. Ta tak i magen og trekk den ut av thoraxen. For å utfolde tarmen, ta tak i avlingen og trekk tarmen litt fremre bort fra magen.
4. Ta tak i den bakre enden av magen med ett par tang og kanten av den fremre åpne kutikulære med det andre par tang. Vær forsiktig så du ikke ødelegger det fremspringende tarmvevet. Trekk den bakre enden bort for å bryte kutiklet og fortsett å trekke bakre veldig forsiktig til hele tarmen er trukket ut av bukhulen. Avlingen må kanskje fjernes på forhånd hvis den er for stor til å passe gjennom kroppshulen.
5. Fjern foregut, malpighiske tubules, hindgut og eggstokkene forlater den nakne midgut.
6. Bruk en pasteurpipette i glass, overfør batchen av dissekerte midguts til et 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder kald 1x PBS / 1% BSA-løsning og hold røret på is. Prøvene må behandles innen 2 timer.
7. Etter at disseksjonen av en hel batch er fullført, skyll disseksjonsfatet med dobbelt destillert vann for å vaske av igjen over rusk. Begynn å dissekere neste gruppe midguts (gjenta trinn 2.1-2.7). Disseker så mange partier som mulig innen 2 timer, og fortsett deretter til trinn 3.1.

3. Fordøyelsen av tarmvevet for å høste celler for FAC-sortering

1. Fjern 1x PBS/1% BSA-løsningen fra midguts og tilsett 500 μl 0,5% Trypsin-EDTA-løsning i hver prøve.
2. Vortex godt i 20 sek og inkuber prøvene ved forsiktig gynging / rotering ved 20 rpm ved romtemperatur i 25-30 min.
3. Virvel igjen etter ca 30 min og la det intakte midgutvevet synke til bunnen av røret. Fjern forsiktig cellene som er i suspensjon med en flammet glass Pasteur pipette og filtrer dem gjennom et 35 μm nylonnett i et friskt 1,5 ml mikrosenterrør.
4. Snurr cellene ned ved 100 x g i 5 min ved 4 °C. Vær oppmerksom på at når du starter fordøyelsen, kan det hende at en cellepellet ikke er synlig i begynnelsen, men blir synlig etter hvert som vevsfordøydet utvikler seg.
   1. Overfør Trypsin-oppløsningen forsiktig tilbake til det originale prøverøret som inneholder det gjenværende intakte midgutvevet. Unngå å overføre for mange celler fra pelletsen.
   2. Re-suspendere cellepellet forsiktig i 400 μl kald 1x PBS / 1% BSA. Hold mikrosentrifugerørene som inneholder de dissosierte cellene på is og dekk rørene med aluminiumsfolie for å beskytte cellene mot lys.
   3. Virvel Trypsin-oppløsningen som inneholder det gjenværende intakte midgutvevet igjen og legg prøvene på rockeren i ytterligere 30 minutter ved romtemperatur.
5. Gjenta trinn 3.3 til 3.4.3 til hele midgutvevet er fordøyd. Kombiner de dissosierte cellene fra alle mikrocentrifugerør i ett mikrosenterrør. Dette kan kreve et sentrifugeringstrinn som i 3,4, siden volumet av alle celle suspensjoner kombinert kan overstige 1,5 ml. Hold celleopphenget på is og beskytt cellene mot lys.
6. Snurr de dissosierte cellene ned ved 100 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern forsiktig så mye av supernatanten som mulig og la ca. 50-100 μl av 1x PBS / 1% BSA-løsningen i mikrocentrifugerøret. Resuspender forsiktig de dissosierte cellene i 800 μl 1x PBS/1% BSA som inneholder Sytox (1:20,000).
7. Overfør cellefjæringen til et 5 ml rund bunn Falcon-rør ved å filtrere cellene gjennom en cellesil snap cap (35 μm nylonnett). Oppbevar alltid celleprøver på is og beskyttet mot lys. Cellene er nå klare til å sorteres.
8. Pipette 600 μl RNAlater-oppløsning i hvert mikrosenterfugerør der cellene sorteres for etterfølgende RNA-isolasjon. For andre nedstrømsapplikasjoner kan cellene samles i en annen løsning, for eksempel i steril PBS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting