Dissekering av Midgut från en vuxenfluga: En metod för att isolera matsmältningssystemet

Overview

I den här videon belyser vi en dissekering av den vuxna Drosophila tarmen och samling av midguts lämplig för encells dissociation och FACS för att isolera intestinala stamceller.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Tauc et al., Isolera intestinala stamceller från vuxna Drosophila Midguts av FACS för att studera stamcellsbeteende under åldrande, J. Vis. Exp. (2014).

OBS: Om detta protokoll används för första gången för att isolera ISC genom FAC-sortering är följande kontroller obligatoriska för att initialt ställa in FACS-parametrarna korrekt: Dissocierade celler från vildtyp (t.ex. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts utan Sytox. Dissocierade celler från vildtyp (t.ex. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts med Sytox (se steg 3.6). Dissocierade celler från midguts av esg-Gal4, UAS-GFP fly line utan Sytox.

1. Förberedelse av lösningar och rätter för tarm dissekering

1. Förbered 4-6 flaskor vardera innehållande 40 kvinnliga flugor från esg-Gal4, UAS-GFP fly line.
2. Från en 10x PBS-stamlösning bered 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄· H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, justera pH till 7,4).
3. Förbered en 3,5% agaroslösning i 1x PBS (3,5 g elektroforeskvalitet agarosa i 100 ml 1x PBS). Förbered dissekeringsplattor genom att hälla denna lösning i petriskålar (diameter 8,5 cm) för att täcka botten. Agaroseskiktet förhindrar att tångspetsarna skadas under dissekeringsproceduren. När gelén har stelnat förvara dissekeringsplattorna vid 4 °C.
4. Bered 300 ml 1x PBS + 1% BSA färsk före dissekering och placera flaskan på is eller vid 4 °C.
5. Slå på centrifugen och låt den svalna till 4 °C.
6. Flamma spetsarna på 2 glas Pasteur-pipetter för att jämna ut kanterna.
7. Rengör två par tång och ett rakblad med 70% etanol.
8. Placera fyra till sex 1,5 ml mikrocentrifugrör för insamling av dissekerade midguts på is.

2. Förberedelse av mag-tarmkanalen och dissekering av Midgut

1. Söva flugor från en flaska (40 flugor) med CO₂ på en vanlig flugsäng, halshugg alla flugor med ett rakblad och överför dem till dissekeringsfatet. Häll kall 1x PBS/1% BSA-lösning i dissekeringsformen för att täcka agarosgelen. Flugorna flyter.
2. Ta tag i flug buken med ett par tång, samtidigt som du håller bröstkorgen med det andra paret tång. Separera bröstkorgen från buken. Tarmen kommer att vara synlig och fram/ grödan kommer sannolikt fortfarande att vara ansluten till bröstkorgen.
3. Ta tag i tarmen och dra ut den ur bröstkorgen. För att veckla ut tarmen, ta tag i grödan och dra tarmen något främre bort från buken.
4. Ta tag i bukens bakre ände med ett par tång och kanten på den främre öppna nagelbandet med det andra paret tång. Var försiktig så att du inte förstör den utskjutande tarmvävnaden. Dra bort den bakre änden för att bryta nagelbandet och fortsätt att dra bakre mycket försiktigt tills hela tarmen har dragits ut ur bukhålan. Grödan kan behöva avlägsnas i förväg om den är för stor för att passa genom kroppshålan.
5. Ta bort foregut, malpighian tubules, hindgut och äggstockar lämnar den nakna midgut.
6. Använd en pastörpipett i glas, överför satsen av dissekerade midguts till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller kall 1x PBS/1% BSA-lösning och håll röret på is. Proverna måste bearbetas inom 2 timmar.
7. När dissekeringen av en hel sats är klar, skölj dissekeringsskålen med dubbelt destillerat vatten för att tvätta bort överblivet skräp. Börja dissekera nästa omgång midguts (upprepa steg 2.1–2.7). Dissekera så många batchar som möjligt inom 2 timmar och fortsätt sedan till steg 3.1.

3. Matsmältning av tarmvävnaden för att skörda celler för FAC-sortering

1. Ta bort 1x PBS/1% BSA-lösningen från midguts och tillsätt 500 μl 0,5% Trypsin-EDTA-lösning till varje prov.
2. Virvelbrunn i 20 sekunder och inkubera proverna genom att försiktigt gunga/rotera vid 20 varv/min vid rumstemperatur i 25-30 min.
3. Virvel igen efter ca 30 min och låt den intakta midgutvävnaden sjunka till botten av röret. Ta försiktigt bort cellerna som är upphängda med en flamad pastörpipett i glas och filtrera dem genom ett 35 μm nylonnät till ett friskt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
4. Snurra ner cellerna vid 100 x g i 5 min vid 4 °C. Observera, när du startar matsmältningen kanske en cellpellet inte är synlig först men kommer att bli synlig när vävnadssmältningen fortskrider.
   1. Överför försiktigt Trypsin-lösningen tillbaka till det ursprungliga provröret som innehåller den återstående intakta midgutvävnaden. Undvik att överföra för många celler från pelleten.
   2. Suspendera försiktigt cellpelleten i 400 μl kall 1x PBS/1% BSA. Håll mikrocentrifugrören som innehåller de dissocierade cellerna på is och täck rören med aluminiumfolie för att skydda cellerna från ljus.
   3. Virvel trypsinlösningen som innehåller den återstående intakta midgutvävnaden igen och placera proverna på vippen i ytterligare 30 minuter vid rumstemperatur.
5. Upprepa steg 3.3 till 3.4.3 tills all midgutvävnad har smälts. Kombinera de dissocierade cellerna från alla mikrocentrifugrör i ett mikrocentrifugrör. Detta kan kräva ett centrifugationssteg som i 3.4, eftersom volymen av alla cellupphängningar tillsammans kan överstiga 1,5 ml. Håll cellupphängningen på is och skydda cellerna från ljus.
6. Snurra ner de dissocierade cellerna vid 100 x g i 5 min vid 4 °C. Ta försiktigt bort så mycket av supernatanten som möjligt och lämna cirka 50-100 μl av 1x PBS/1% BSA-lösningen i mikrocentrifugröret. Återanvänd försiktigt de dissocierade cellerna i 800 μl 1x PBS/1% BSA innehållande Sytox (1:20 000).
7. Överför cellfjädringen till ett 5 ml rund botten Falcon-rör genom att filtrera cellerna genom ett cellsilsnäpplock (35 μm nylonnät). Förvara alltid cellprover på is och skyddad mot ljus. Cellerna är nu redo att sorteras.
8. Pipett 600 μl RNAlater-lösning i varje mikrocentrifugrör i vilket cellerna sorteras för efterföljande RNA-isolering. För andra nedströmsapplikationer kan cellerna samlas i en annan lösning, t.ex. i steril PBS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting