Dissezione del Midgut da una mosca adulta: un metodo per isolare il tratto digestivo

Overview

In questo video, evidenziamo una dissezione dell'intestino drosofilo adulto e la raccolta di moscerini adatti alla dissociazione a una cellula e facs al fine di isolare le cellule staminali intestinali.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Tauc et al., Isolando le cellule staminali intestinali dai moscerini della Drosophila adulta della FACS per studiare il comportamento delle cellule staminali durante l'invecchiamento, J. Vis. Exp. (2014).

NOTA: Se questo protocollo viene utilizzato per la prima volta per isolare gli ISC mediante ordinamento FAC, i seguenti controlli sono obbligatori per impostare inizialmente correttamente i parametri FACS: Celle dissociate da tipi selvatici (ad esempio w¹¹¹⁸) Midgut Drosophila senza Sitox. Cellule dissociate di tipo selvatico (ad esempio w¹¹¹⁸) Midguts Drosophila con sitox (vedere fase 3.6). Cellule dissociate dai moscerini della linea di volo esg-Gal4, UAS-GFP senza Sitox.

1. Preparazione di soluzioni e piatti per la dissezione intestinale

1. Preparare 4-6 fiale ciascuna contenente 40 mosche femminili dalla linea di volo esg-Gal4, UAS-GFP.
2. Da una soluzione di magazzino PBS 10x preparare 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄· H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, regolare il pH a 7,4).
3. Preparare una soluzione di agarosio al 3,5% in 1 PBS (3,5 g di agarosio di grado elettroforesi in 100 ml 1x PBS). Preparare le piastre di dissezione versando questa soluzione in piastre di Petri (diametro 8,5 cm) per coprire il fondo. Lo strato di agarosio impedisce di danneggiare le punte delle punte durante la procedura di dissezione. Dopo che il gel ha solidificato conservare le piastre di dissezione a 4 °C.
4. Preparare 300 ml di 1x PBS + 1% di BSA fresco prima di sezionare e posizionare la bottiglia sul ghiaccio o a 4 °C.
5. Accendere la centrifuga e lasciarla raffreddare a 4 °C.
6. Fiammare le punte di 2 pipette Pasteur in vetro per levigare i bordi.
7. Pulire due paia di forcep e una lama di rasoio con il 70% di etanolo.
8. Posizionare da quattro a sei tubi di microcentrifugo da 1,5 ml per la raccolta di moscerini sezionati sul ghiaccio.

2. Preparazione del tratto gastrointestinale e dissezione del midgut

1. L'anestetizza vola da una fiala (40 mosche) con CO₂ su un letto a mosca standard, decapita tutte le mosche usando una lama di rasoio e trasferiscile nel piatto di dissezione. Versare la soluzione di BSA 1x PBS/1% fredda nella piastra di dissezione per coprire il gel di agarosio. Le mosche galleggeranno.
2. Afferra l'addome di mosca con un paio di forcep, tenendo il torace con l'altra coppia di forcep. Separare il torace dall'addome. L'intestino sarà visibile e il foregut / raccolto molto probabilmente sarà ancora collegato al torace.
3. Prendi l'intestino e tiralo fuori dal torace. Per aprire l'intestino, afferrare il raccolto e tirare l'intestino leggermente anterioremente lontano dall'addome.
4. Afferrare l'estremità posteriore dell'addome con un paio di forcep e il bordo della cuticola aperta anteriormente con l'altra coppia di forcep. Fai attenzione a non distruggere il tessuto intestinale sporgente. Tirare via l'estremità posteriore per rompere la cuticola e continuare a tirare posteriormente molto delicatamente fino a quando l'intero intestino non è stato estratto dalla cavità addominale. Il raccolto potrebbe essere necessario rimuovere in anticipo se è troppo grande per adattarsi attraverso la cavità corporea.
5. Rimuovere il foregut, i tubuli malpighiani, il broncio posteriore e le ovaie lasciando il midgut nudo.
6. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, trasferire il lotto di moscerini sezionati in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml contenente soluzione di BSA a freddo 1x PBS/1% e mantenere il tubo sul ghiaccio. I campioni devono essere elaborati entro 2 ore.
7. Una volta completata la dissezione di un intero lotto, sciacquare la piastra di dissezione con acqua distillata doppia per lavare via i detriti lasciati. Iniziare a sezionare il lotto successivo di moscerini (ripetere i passaggi da 2.1 a 2.7). Sezionare il maggior numero possibile di lotti entro 2 ore, quindi procedere al passaggio 3.1.

3. Digestione del tessuto intestinale per raccogliere cellule per lo smistamento FAC

1. Rimuovere la soluzione 1x PBS/1% BSA dai moscerini e aggiungere 500 μl di soluzione di Tripsina-EDTA allo 0,5% a ciascun campione.
2. Vortice bene per 20 secondi e incubare i campioni dondolando delicatamente/ruotando a 20 giri/min a temperatura ambiente per 25-30 min.
3. Vortice di nuovo dopo circa 30 minuti e lasciare che il tessuto midgut intatto affondi sul fondo del tubo. Rimuovere con cura le celle in sospensione con una pipetta Pasteur in vetro fiammato e filtrarle attraverso una rete di nylon da 35 μm in un tubo fresco di microcentrifugo da 1,5 ml.
4. Ruotare le cellule verso il basso a 100 x g per 5 minuti a 4 °C. Nota, quando si avvia il digest, un pellet cellulare potrebbe non essere visibile all'inizio, ma diventerà visibile man mano che il digeribile del tessuto progredisce.
   1. Trasferire con cura la soluzione di tripina al tubo campione originale contenente il tessuto midgut intatto rimanente. Evitare di trasferire troppe cellule dal pellet.
   2. Sospendere delicatamente il pellet cellulare in 400 μl di BSA freddo 1x PBS/1%. Mantenere i tubi di microcentrifugo contenenti le celle dissociate sul ghiaccio e coprire i tubi con un foglio di alluminio per proteggere le cellule dalla luce.
   3. Vortice la soluzione di triptina contenente di nuovo il tessuto midgut intatto rimanente e posizionare i campioni sul rocker per altri 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.4.3 fino a quando tutto il tessuto midgut non è stato digerito. Unire le celle dissociate da tutti i tubi di microcentrifugo in un unico tubo di microcentrifugo. Ciò può richiedere una fase di centrifugazione come al punto 3.4, poiché il volume di tutte le sospensioni cellulari combinate può superare 1,5 ml. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio e proteggere le cellule dalla luce.
6. Ruotare le cellule dissociate verso il basso a 100 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere con cura la maggior parte del supernatante possibile lasciando circa 50-100 μl della soluzione 1x PBS/1% BSA nel tubo di microcentrifugo. Rimossare delicatamente le cellule dissociate in 800 μl 1x PBS/1% BSA contenente Sitox (1:20.000).
7. Trasferire la sospensione cellulare su un tubo Falcon rotondo da 5 ml filtrando le celle attraverso un tappo a scatto del filtro cellulare (rete di nylon da 35 μm). Tenere sempre i campioni di cellule sul ghiaccio e protetti dalla luce. Le celle sono ora pronte per essere ordinate.
8. Pipetta 600 μl di soluzione RNAlater in ogni tubo di microcentrifugo in cui le cellule verranno ordinate per il successivo isolamento dell'RNA. Per altre applicazioni a valle le cellule possono essere raccolte in una soluzione diversa, ad esempio in PBS sterile.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting