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Biochemistry

Escherichia कोलाई आधारित पूरक परख हीट शॉक प्रोटीन 70 के Chaperone समारोह का अध्ययन करने के लिए

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry & Microbiology, University of Venda

Summary

यह प्रोटोकॉल हीट शॉक प्रोटीन 70 (एचएसपी 70) की चैपरोन गतिविधि को प्रदर्शित करता है। ई. कोलाई dnaK756 कोशिकाएं परख के लिए एक मॉडल के रूप में काम करती हैं क्योंकि वे एक देशी, कार्यात्मक रूप से बिगड़ा हुआ Hsp70 को बंद करते हैं, जिससे वे गर्मी के तनाव के लिए अतिसंवेदनशील हो जाते हैं। कार्यात्मक एचएसपी 70 का विषम परिचय कोशिकाओं की वृद्धि की कमी को बचाता है।

Abstract

हीट शॉक प्रोटीन 70 (एचएसपी 70) एक संरक्षित प्रोटीन है जो कोशिका के भीतर अन्य प्रोटीनों को मोड़ने की सुविधा प्रदान करता है, जिससे यह आणविक संरक्षक बन जाता है। जबकि एचएसपी 70 सामान्य परिस्थितियों में बढ़ने वाली ई कोलाई कोशिकाओं के लिए आवश्यक नहीं है, यह चैपरोन ऊंचे तापमान पर विकास के लिए अपरिहार्य हो जाता है। चूंकि Hsp70 अत्यधिक संरक्षित है, विभिन्न प्रजातियों से Hsp70 जीन के चैपरोन फ़ंक्शन का अध्ययन करने का एक तरीका यह है कि उन्हें E. coli उपभेदों में विषम रूप से व्यक्त किया जाए जो या तो Hsp70 में कमी रखते हैं या एक देशी Hsp70 को व्यक्त करते हैं जो कार्यात्मक रूप से समझौता किया जाता है। ई. कोलाई dnaK756 कोशिकाएं λबैक्टीरियोफेज डीएनए का समर्थन करने में असमर्थ हैं। इसके अलावा, उनके मूल Hsp70 (DnaK) GrpE (Hsp70 न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर) के लिए कम आत्मीयता का प्रदर्शन करते हुए उन्नत ATPase गतिविधि प्रदर्शित करता है। नतीजतन, ई. कोलाई डीएनएके 756 कोशिकाएं 30 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान पर पर्याप्त रूप से बढ़ती हैं, लेकिन वे ऊंचे तापमान (>40 डिग्री सेल्सियस) पर मर जाती हैं। इस कारण से, ये कोशिकाएं एचएसपी 70 की चैपरोन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में काम करती हैं। यहां, हम एक पूरक परख का संचालन करने के लिए इन कोशिकाओं के आवेदन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो एचएसपी70के सेल्यूलो चैपरोन फ़ंक्शन के अध्ययन को सक्षम करता है।

Introduction

हीट शॉक प्रोटीन प्रोटीन तह की सुविधा के द्वारा आणविक चैपरोन के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने, और प्रोटीन misfolding 1,2 उलट कर. हीट शॉक प्रोटीन 70 (एचएसपी 70) सबसे प्रमुख आणविक चैपरोन में से एक है, जो प्रोटीन होमियोस्टेसिस 3,4 में केंद्रीय भूमिका निभा रहा है। DnaK ई कोलाई Hsp70 homologue5 है।

विभिन्न biophysical, जैव रासायनिक, और सेल आधारित assays Hsp70 के chaperone गतिविधि का पता लगाने के लिए और इस चैपरोन 6,7,8 को लक्षित अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए विकसित किया गया है. एचएसपी 70 एक अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन है। इस कारण से, यूकेरियोटिक जीवों के कई Hsp70s, जैसे प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम (मलेरिया का मुख्य एजेंट), ई. कोलाई 6,9में DnaK फ़ंक्शन के विकल्प के लिए सूचित किया गया है। इस तरह, एक ई कोलाई-आधारित पूरक परख विकसित की गई है जिसमें ई कोलाई में एचएसपी 70 के विषम अभिव्यक्ति को शामिल किया गया है ताकि उनके साइटोप्रोटेक्टिव फ़ंक्शन का पता लगाया जा सके। आमतौर पर, इस परख में ई कोलाई कोशिकाओं का उपयोग शामिल होता है जो या तो डीएनएके के लिए कमी होती हैं या जो एक देशी डीएनएके व्यक्त करती हैं जो कार्यात्मक रूप से समझौता किया जाता है। जबकि DnaK सामान्य परिस्थितियों में ई कोलाई विकास के लिए आवश्यक नहीं है, यह आवश्यक हो जाता है जब कोशिकाओं को इस तरह के ऊंचा तापमान या तनाव10,11 के अन्य रूपों के रूप में तनावपूर्ण परिस्थितियों में उगाया जाता है.

ई. कोलाई उपभेदों है कि एक पूरक परख का उपयोग कर Hsp70 समारोह का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है ई कोलाई dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 (Am) thr::Tn10]) और ई कोलाई dnaK756 शामिल हैं. ई कोलाई dnaK103 कोशिकाओं गैर कार्यात्मक है कि एक काटे DnaK उत्पादन, और इस तरह, कोशिकाओं 30 डिग्री सेल्सियस पर पर्याप्त रूप से विकसित, जबकि तनाव ठंड और गर्मीतनाव 12,13 के प्रति संवेदनशील है. इसी तरह, ई. कोलाई dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) तनाव 40 डिग्री सेल्सियस14,15 से ऊपर नहीं बढ़ता है। ई. कोलाई dnaK756 तनाव एक उत्परिवर्ती देशी DnaK व्यक्त करता है (DnaK756) 32, 455, और 468 पदों पर तीन ग्लाइसिन-टू-एस्पेरेट प्रतिस्थापन की विशेषता, समझौता प्रोटियोस्टेटिक परिणामों को जन्म दे. नतीजतन, यह तनाव बैक्टीरियोफेज λ डीएनए14 के लिए प्रतिरोधी है। इसके अतिरिक्त, ई. कोलाई dnaK756 ऊंचा ATPase गतिविधि को प्रदर्शित करता है, जबकि न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक, GrpE के लिए इसकी आत्मीयता16 कम हो जाती है। ई. कोलाई DnaK उत्परिवर्ती उपभेद एक पूरक दृष्टिकोण के माध्यम से Hsp70 की चैपरोन गतिविधि की जांच के लिए आदर्श मॉडल के रूप में काम करते हैं। चूंकि DnaK केवल तनावपूर्ण परिस्थितियों में आवश्यक है, पूरक परख आमतौर पर ऊंचा तापमान(चित्रा 1)पर आयोजित की जाती है। इस अध्ययन के लिए ई कोलाई का उपयोग करने के कुछ फायदे इसकी अच्छी तरह से विशेषता जीनोम, तेजी से विकास, और संवर्धन और रखरखाव17 की कम लागत शामिल हैं.

इस लेख में, हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें एचएसपी 70 के कार्य का अध्ययन करने के लिए ई कोलाई डीएनएके 756 कोशिकाओं का उपयोग शामिल है। परख में हमारे द्वारा नियोजित Hsp70s जंगली-प्रकार DnaK और इसके काइमेरिक व्युत्पन्न, KPf (प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम Hsp70-1 6,18 के सी-टर्मिनल सब्सट्रेट-बाइंडिंग डोमेन से जुड़े DnaK के ATPase डोमेन से बना है)। KPf-V436F विषम रूप से एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में व्यक्त किया गया था क्योंकि उत्परिवर्तन अनिवार्य रूप से इसे बाध्यकारी सब्सट्रेट से अवरुद्ध करता है, इस प्रकार इसकी चैपरोन गतिविधि9 को निरस्त कर देता है।

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Protocol

1. परिवर्तन

नोट: संस्कृति, विंदुक युक्तियों, और ताजा तैयार और आटोक्लेव्ड मीडिया के लिए बाँझ कांच के बने पदार्थ का उपयोग करें। 2x खमीर ट्रिप्टोन (YT) [1.6% ट्रिप्टोन (w/v), 1% खमीर निकालने (w/v), 0.5% NaCl (w/v), 1.5% अगर (w/v)] अगर में ई कोलाई कोशिकाओं की संस्कृतियों को तैयार करें। प्रोटोकॉल और उनके स्रोतों में उपयोग किए जाने वाले सामान्य अभिकर्मकों को सामग्री की तालिका में प्रदान किया जाता है।

  1. लेबल 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सक्षम ई कोलाई डीएनएके 756कोशिकाओं के विभाज्य 50 माइक्रोन, कोशिकाओं को बर्फ पर रखते हुए।
  2. सक्षम कोशिकाओं के साथ 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के लिए, अलग-अलग ट्यूबों में pQE60/DnaK, pQE60/KPf, और pQE60/KPf-V436F प्लाज्मिड डीएनए9 के विभाज्य 10-50 एनजी।
  3. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं और प्लाज्मिड डीएनए युक्त 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
  4. हीट शॉक सक्षम कोशिकाओं-डीएनए मिश्रण को 42 डिग्री सेल्सियस पर 60 एस के लिए और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को 10 मिनट के लिए बर्फ पर वापस लौटा दें।
  5. ताजा 2x YT शोरबा (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ऊष्मायन) के 950 माइक्रोन जोड़ें और 1 घंटे के लिए 150 क्रांतियों/मिनट पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि आवश्यक हो तो उनकी वसूली को प्रोत्साहित करने के लिए कोशिकाओं को अधिक समय तक बढ़ने के लिए छोड़ दें।
    नोट: कोशिकाओं को जोर से मिलाते हुए से बचें.
  6. कोशिकाओं के पिपेट 100 माइक्रोन और उन्हें प्लाज्मिड चयन के लिए 50 माइक्रोग्राम/एमएल कनामाइसिन, 10 माइक्रोग्राम/एमएल टेट्रासाइक्लिन युक्त 2x वाईटी अगर प्लेटों पर फैलाएं, और प्लाज्मिड चयन के लिए 100 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलीन ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 5000 x ग्राम (4 डिग्री सेल्सियस पर) पर 1 मिन के लिए बाकी कोशिकाओं (जिनकी मात्रा अब लगभग 900 माइक्रोन है) को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. शोरबा के लगभग 800 माइक्रोन को छान लें और गोली कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए शेष माध्यम का उपयोग करें।
  9. बरामद कोशिकाओं को 2x YT अगर प्लेट पर प्लेट करें।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (या लगभग 17 घंटे) दोनों अगर प्लेटों सेते हैं.
    नोट: ये कोशिकाएं बहुत धीरे-धीरे बढ़ती हैं और उन्हें लंबे समय तक इनक्यूबेट करने की आवश्यकता हो सकती है। कॉलोनियों को स्पॉट करने के लिए सावधान रहें जो बहुत छोटे से शुरू हो सकते हैं। सेंट्रीफ्यूजेशन (चरण 1.7) के बाद पुन: निलंबित कोशिकाओं वाली प्लेट कोशिकाओं की परिवर्तन दक्षता खराब होने की स्थिति में बैक-अप के रूप में कार्य करती है, जिस स्थिति में गोली कोशिकाएं किसी भी रूपांतरित कोशिकाओं की वसूली में सुधार कर सकती हैं। हालांकि, अगर परिवर्तन दक्षता उत्कृष्ट है, अगर प्लेट जिस पर केंद्रित कोशिकाओं चढ़ाया गया इनक्यूबेशन पर एक ऊंचा संस्कृति की विशेषता हो सकती है, जिससे एकल कालोनियों की पहचान करना मुश्किल हो जाता है। उस स्थिति में, अन्य अगर प्लेट वह हो सकती है जिस पर अच्छी तरह से दूरी वाली कॉलोनियां बढ़ती हैं।

2. सेल चढ़ाना

  1. ट्रांसफार्मर से एक एकल कॉलोनी उठाओ और इसे 2x YT शोरबा के 10 एमएल में टीका लगाएं, जो 50 माइक्रोग्राम/एमएल केनामाइसिन, 10 माइक्रोग्राम/एमएल टेट्रासाइक्लिन के साथ ई . कोलाई डीएनएके756 कोशिकाओं के चयन के लिए पूरक है, और प्लाज्मिड चयन के लिए 100 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलीन।
    नोट: संस्कृति को उत्तेजित करते समय वातन सुनिश्चित करने के लिए फ्लास्क (≥50 एमएल) का उपयोग करें। 150 घुमाव/मिनट पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (17 घंटे) इनोकुलम इनक्यूबेट करें।
  2. अगली सुबह ओडी600 पर एक अवशोषण रीडिंग लें।
  3. सेल स्पॉटिंग की तैयारी में सतह को स्वाब करने के लिए 75% इथेनॉल का उपयोग करके कार्यक्षेत्र की सतह को साफ करें।
  4. 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करके, 2x वाईटी शोरबा का उपयोग करके 2.0 के आयुध डिपो600 पढ़ने के लिए संस्कृति को मानकीकृत करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि आयुध डिपो रीडिंग सही ढंग से लिया जाता है क्योंकि यह कदम विभिन्न नमूनों में सेल घनत्व को मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके, कोशिकाओं के धारावाहिक कमजोर पड़ने को 100 से 10-5 तक तैयार करें।
  6. अगर प्लेटों 40 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन सेट में स्पॉट करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए सेते प्लेटों आंशिक रूप से खुला ढक्कन के साथ सूखी करने के लिए अनुमति देने के लिए जल वाष्प बच जाता है.
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को समान रूप से अलग दूरी पर देखा जाता है, कागज के एक टुकड़े पर रेखाएं खींचें, जिस पर स्पॉटिंग साइटों का एक टेम्पलेट मुद्रित होता है।
  7. 50 माइक्रोग्राम/एमएल कनामाइसिन, 10 माइक्रोग्राम/एमएल टेट्रासाइक्लिन, 100 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलीन, और 0.5 एमएम आईपीटीजी (पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के प्रेरण के लिए) के साथ पूरक अगर प्लेटों पर क्रमिक रूप से पतला कोशिकाओं के स्पॉट 2 माइक्रोन ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  8. प्रत्येक नमूने को दो अलग-अलग प्लेटों पर स्पॉट करें (एक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाना है और दूसरा 43.5 डिग्री सेल्सियस पर)।
    नोट: अगर थाली भेदी से बचें.
  9. पर्यावरणीय प्रभावों को कम करने के लिए प्रयोगात्मक नमूनों के रूप में एक ही प्लेट पर स्पॉट नियंत्रण नमूने।
  10. कोशिकाओं के बढ़ने से पहले प्रक्रिया पूरी हो गई है, यह सुनिश्चित करने के लिए जल्दी से स्पॉटिंग का संचालन करें, क्योंकि यह विषम विकास पैटर्न उत्पन्न कर सकता है।
    नोट: स्पॉटिंग करते समय एरोसोल से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ये प्लेटों को दूषित करेंगे। संदूषण से बचने के लिए स्पॉटिंग के बीच प्लेटों को बंद रखना भी महत्वपूर्ण है।
  11. एक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस (अनुमेय वृद्धि तापमान) पर और दूसरे को 43.5 डिग्री सेल्सियस के गैर-अनुमेय विकास तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: ढक्कन पर एकत्रित भाप से बचने के लिए उल्टा सामना करना पड़ प्लेटों सेते हैं, के रूप में संघनित पानी उनके पदों बंद धब्बेदार कालोनियों धो होगा.
  12. एक ही समय में इनक्यूबेटरों में सभी प्लेटों प्लेस और अगली सुबह तक इनक्यूबेटर खोलने से बचने.
    नोट: प्लेटों के इनक्यूबेशन के दौरान इनक्यूबेटर दरवाजा कई बार खोलना हतोत्साहित किया जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि इनक्यूबेटर में हवा की पहुंच के परिणामस्वरूप तापमान में उतार-चढ़ाव हो सकता है जो सेल विकास पर प्रतिकूल प्रभाव डालता है।

3. पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि

  1. एक बाँझ पाश का प्रयोग, रूपांतरित ई कोलाई dnaK756 कोशिकाओं की एक ही कॉलोनी से शेष कोशिकाओं का हिस्सा लेने.
  2. कोशिकाओं को 50 μg/mL कनामाइसिन, 10 μg/mL टेट्रासाइक्लिन और 100 μg/mL एम्पीसिलीन के साथ पूरक 10 एमएल वाईटी शोरबा में टीका लगाएं। 150 क्रांतियों/मिनट पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (17 घंटे) सेते हैं।
  3. चरण 3.2 में उल्लिखित आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं वाले बाँझ 2x YT शोरबा के 90 एमएल में संस्कृति को स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को मध्य-लॉग चरण (आयुध डिपो600 = 0.4-0.6) तक बढ़ने दें।
  4. प्रेरण से पहले नमूना संस्कृति के 2 एमएल लें (0 घंटे प्रेरण नमूना)।
  5. प्रोटीन उत्पादन को प्रेरित करने के लिए 1 मिमी की अंतिम एकाग्रता में आईपीटीजी जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को फिर से इनक्यूबेट करें।
  6. एक दूसरे 2 एमएल नमूना 6 घंटे के बाद प्रेरण ले लो.
  7. 10 मिनट के लिए 5000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं हार्वेस्ट. अपकेंद्रित्र तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. पीबीएस बफर (137 एमएम एनएसीएल, 27 एमएम केसीएल, 4.3 एमएम एनए2एचपीओ4, 1.4 एमएम केएच2पीओ4) में गोली को फिर से निलंबित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

  1. 2x 10% एसडीएस जैल तैयार करें जैसा कि पहले19 वर्णित है।
  2. प्रोटीन बैंड को देखने के लिए Coomassie दाग का उपयोग कर बाद धुंधला हो जाना के लिए एसडीएस पेज जैल में से एक रखें. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए दूसरे एसडीएस-पेज जेल का उपयोग करें।
  3. पुन: निलंबित नमूनों के विभाज्य 80 माइक्रोन और इसे 4x लेमली एसडीएस लोडिंग बफर के 20 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
  4. 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन उबालें। फिर प्रीकास्ट एसडीएस जेल पर प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोन लोड करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. बफर चलाने वाले एसडीएस के 1x समाधान में 120 वी के वोल्टेज का उपयोग करके 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर वैद्युतकणसंचलन करें (25 मिमी ट्रिस, 250 मिमी ग्लाइसिन, 0.1% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस)।
  6. 1 घंटे के लिए Coomassie दाग ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ जेल दाग, 2 घंटे के लिए डिस्टेनिंग बफर (50% (वी / वी) मेथनॉल, 10% (वी / वी) आसुत जल में एसिटिक एसिड) का उपयोग करके बनाए रखने के बाद।
  7. जेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके जेल में मौजूद प्रोटीन बैंड की कल्पना करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। उपर्युक्त प्रोटोकॉल के बाद एक ही नमूने के साथ एक और एसडीएस-पेज जेल को फिर से चलाएं।
  8. जब इलेक्ट्रोफोरेटिक रन समाप्त होता है, तो पहले19 वर्णित के रूप में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए एसडीएस-पेज जैल लें।
  9. नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को धोएं जिस पर प्रोटीन धोने बफर (टीबीएस-ट्वीन, पीएच 7.4 [50 एमएम ट्रिस, 150 एमएम एनएसीएल, 1% (वी / वी) ट्वीन]) में तीन बार स्थानांतरित किए गए थे।
  10. क्रमशः KPf और इसके उत्परिवर्ती, KPf-V436F) का पता लगाने के लिए DnaK और α-PfHsp70-17 का पता लगाने के लिए α-DnaK (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
  11. 5% गैर-वसा वाले दूध में 1:2000 कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी का उपयोग करें। 1 घंटे के लिए 60 क्रांतियों/मिनट पर मिलाते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  12. 15 मिनट में 3 बार टीबीएस-ट्वीन में नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली धोने से गैर-विशेष रूप से बाध्य एंटीबॉडी निकालें।
  13. पिछले चरण के समान परिस्थितियों में माध्यमिक एंटीबॉडी (α-खरगोश, सामग्री की तालिकादेखें) में झिल्ली को इनक्यूबेट करें। इसके बाद प्राथमिक एंटीबॉडी के समान परिस्थितियों में बाद में धुलाई की जाती है।
  14. बढ़ाया chemiluminescence (ईसीएल) का पता लगाने अभिकर्मक का उपयोग कर बैंड को हल.
  15. जेल इमेजर का उपयोग करके बैंड की कल्पना करें।

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Representative Results

चित्रा 2 स्कैन किए गए अगर युक्त कोशिकाओं की एक छवि प्रस्तुत करता है जो क्रमशः 37 डिग्री सेल्सियस और 43.5 डिग्री सेल्सियस के अनुमेय विकास तापमान पर देखा और सुसंस्कृत किया गया था। चित्रा 2 के दाईं ओर, उत्तेजित पश्चिमी धब्बा घटक ई. कोलाई dnaK756 कोशिकाओं में DnaK, KPf, और KPf-V436F की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, 37 डिग्री सेल्सियस के अनुमेय विकास तापमान पर सुसंस्कृत सभी ई कोलाई dnaK756 कोशिकाएं बढ़ने में कामयाब रहीं। हालांकि, 43.5 डिग्री सेल्सियस की गैर-अनुमेय विकास स्थितियों के तहत, केवल डीएनएके और केपीएफ को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं बढ़ने में कामयाब रहीं, जैसा कि पहले 6,9,20(चित्रा 2)की सूचना दी गई थी। दूसरी ओर, KPf-V436F व्यक्त करने वाली कोशिकाएं केवल 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ीं लेकिन 43.5 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने में विफल रहीं। यह दर्शाता है कि DnaK और KPf गर्मी तनाव की स्थिति के तहत E. coli dnaK756 कोशिकाओं के विकास दोष को बहाल करने में सक्षम थे। 43.5 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने के लिए केपीएफ-वी 436 एफ को विषम रूप से व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की विफलता इस प्रोटीन के चैपरोन फ़ंक्शन की कमी को दर्शाती है। इस संबंध में, KPf-V436F एक आदर्श नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन के रूप में कार्य करता है।

Figure 1
चित्रा 1: विषम रूप से व्यक्त प्रोटीन के चैपरोन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए ई कोलाई डीएनएके 756 कोशिकाओं का उपयोग करके पूरक परख का सिद्धांत। कोलाई dnaK756 एक देशी DnaK756 प्रोटीन व्यक्त करता है जो गर्मी के तनाव से कोशिकाओं की रक्षा करने में असमर्थ है। कार्यात्मक विषम एचएसपी 70 का परिचय गर्मी के तनाव के संपर्क में आने पर कोशिकाओं को मृत्यु से बचाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गर्मी के तनाव के खिलाफ ई कोलाई dnaK756 कोशिकाओं की रक्षा के लिए DnaK और KPf की क्षमताओं का प्रदर्शन पूरक प्लेट परख। रूपांतरित कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस (अनुमेय विकास तापमान) और 43.5 डिग्री सेल्सियस (गैर-अनुमेय विकास तापमान) पर सुसंस्कृत किया गया था। कोशिकाओं को मानकीकृत किया गया था और धारावाहिक कमजोर पड़ने के रूप में चढ़ाया गया था। 'एन' 'नीट' का प्रतीक है, जो undiluted कोशिकाओं से बना पहला स्थान दर्शाता है। चरम दाईं ओर पश्चिमी धब्बा छांटना तीन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल विषम रूप से व्यक्त Hsp70 के चैपरोन फ़ंक्शन की खोज में E. coli dnaK756कोशिकाओं की उपयोगिता को प्रदर्शित करता है। इस परख को सेलूलो में एचएसपी 70 फ़ंक्शन को लक्षित करने वाले अवरोधकों को स्क्रीन करने के लिए अपनाया जा सकता है। हालांकि, इस विधि की एक सीमा यह है कि Hsp70s E. कोलाई में DnaK के लिए स्थानापन्न करने में असमर्थ इस परख के साथ संगत नहीं हैं. कुछ गैर-देशी एचएसपी 70 के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन21 की कमी ई कोलाई प्रणाली के भीतर उनके कार्य की कमी के लिए जिम्मेदार हो सकती है। एक खमीर आधारित पूरक परख22 ई कोलाई-आधारित परख की कुछ कमियों को संबोधित कर सकता है।

प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम महत्वपूर्ण हैं। इनमें यह सुनिश्चित करना शामिल है कि केवल संबंधित प्लाज्मिड निर्माण द्वारा रूपांतरित कोशिकाओं का उपयोग चढ़ाना के दौरान किया जाता है। इसके अलावा, पूरे चरणों में संस्कृति के संदूषण से बचना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, चूंकि जोर दिया ई कोलाई DnaK कोशिकाओं अत्यधिक फिलामेंटेशन10 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, यह इस शारीरिक तनाव व्यापक फिलामेंटेशन को बढ़ावा देता है के रूप में संस्कृति के दौरान जोरदार झटकों से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. अत्यधिक फिलामेंटेड कोशिकाएं आयुध डिपो600 पर उच्च झूठी स्पष्ट वृद्धि रीडिंग देती हैं, जिससे संस्कृति के विकास का अधिक अनुमान लगाया जाता है और चढ़ाना से पहले सेल मानकीकरण पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है। हालांकि एचएसपी 70 सामान्य परिस्थितियों में ई कोलाई विकास के लिए आवश्यक नहीं है, इस प्रोटीन की कमी कोशिकाओं तनावअतिसंवेदनशील 10 हैं. इस कारण से, ई. कोलाई dnaK756 कोशिकाएं रूपांतरित होने के बाद या ग्लिसरॉल स्टॉक से उनकी वसूली के दौरान बहुत धीमी गति से बढ़ती हैं। इसके अतिरिक्त, वे तापमान में उतार-चढ़ाव के प्रति बेहद संवेदनशील हैं। इसलिए, यह इनक्यूबेटर दरवाजा खोलने से बचने के लिए एक बार मढ़वाया अगर प्लेटों के अंदर रखा जाता है जब तक यह प्लेटों को देखने के लिए समय है.

पश्चिमी धब्बा डेटा ई में संबंधित पुनः संयोजक एचएसपी 70 प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कोलाई dnaK756 कोशिकाओं. संबंधित प्रोटीन को व्यक्त करने में विफलता गैर-अनुमेय विकास तापमान के तहत बढ़ने वाली कोशिकाओं के लिए एक गलत-नकारात्मक परिणाम की ओर ले जाती है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या ब्याज के अन्य संघर्ष नहीं हैं।

Acknowledgments

इस कार्य को इंटरनेशनल सेंटर फॉर जेनेटिक इंजीनियरिंग एंड बायोटेक्नोलॉजी (ICGEB) अनुदान संख्या, HDI/CRP/012, वेंडा विश्वविद्यालय के अनुसंधान निदेशालय, अनुदान I595, विज्ञान और नवाचार विभाग (DSI) और दक्षिण अफ्रीका के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (NRF) (अनुदान संख्या, 75464 और 92598) से प्राप्त अनुदान निधि के साथ समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 8,05,740 Constituent for sample loading dye
Acetic acid Labchem 101005125 Constituent of destainer
Acrylamide Sigma-Aldrich 8008300100 Component of SDS
Agar Merck HG000BX1.500 Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose Clever Scientific 14131031 Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 101875295 Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin VWR International 0339—EU—25G Selective antibiotic
Bis Sigma-aldrich 1015460100 Component of SDS
Bromophenol Sigma-Aldrich 0449-25G Constituent for sample loading dye
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue VWR International 443293X SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate Sigma-Aldrich RB10368 Constituent of PBS buffer
ECL Thermofischer Scientific 32109 Western blot detection reagent
Ethidium Bromide Thermofischer Scientific 17898 DNA intercalating dye
Glycerol Merck SAAR2676520L Constituent for sample loading dye
Glycine VWR International 10119CU Component of SDS
IPTG Glentham life sciences 162IL inducer
Kanamycin Melford K0126 Selective antibiotic
Magnesium Chloride Merck SAAR4123000EM Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol Labchem 113140129 Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate Merck 1,04,87,30,250 Constituent of PBS buffer
Peptone Merck HG000BX4.250 Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride Merck SAAR5042020EM Constituent of PBS buffer
PVDF membrane Thermofischer scientific PB7320 Western blot membrane
Sodium Chloride Merck SAAR5822320EM Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate VWR International 108073 To resolve expressed proteins
Spectramax iD3 Separations 373705019 Automated plate reader
TEMED VWR international ACRO420580500 Component of SDS gel
Tetracycline Duchefa Biochemies T0150.0025 Selective antibiotic
Tris VWR International 19A094101 Component of SDS gel
Tween20 Merck SAAR3164500XF Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber Thermofisher Scientific PB0112 Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract Merck HG000BX6.500 Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody Inqaba BK CAC09317 Primary antibody
α-rabbit antibody Thermofischer scientific 31460 Secondary antibody

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References

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इस महीने JoVE में अंक 205
<i>Escherichia कोलाई </i>आधारित पूरक परख हीट शॉक प्रोटीन 70 के Chaperone समारोह का अध्ययन करने के लिए
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Rachel Ncube, H., Dali, U., Harmfree … More

Rachel Ncube, H., Dali, U., Harmfree Dongola, T., Shonhai, A. Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70. J. Vis. Exp. (205), e66515, doi:10.3791/66515 (2024).

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