Summary
Ce protocole démontre l’activité chaperonne de la protéine de choc thermique 70 (Hsp70). Les cellules E. coli dnaK756 servent de modèle pour le test car elles hébergent un Hsp70 natif et fonctionnellement altéré, ce qui les rend sensibles au stress thermique. L’introduction hétérologue de Hsp70 fonctionnel sauve le déficit de croissance des cellules.
Abstract
La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) est une protéine conservée qui facilite le repliement d’autres protéines dans la cellule, ce qui en fait un chaperon moléculaire. Bien que Hsp70 ne soit pas essentiel à la croissance des cellules E. coli dans des conditions normales, ce chaperon devient indispensable pour la croissance à des températures élevées. Comme Hsp70 est hautement conservé, une façon d’étudier la fonction chaperon des gènes Hsp70 de diverses espèces est de les exprimer de manière hétérologue dans des souches d’E. coli qui sont soit déficientes en Hsp70, soit expriment une Hsp70 native qui est fonctionnellement compromise. Les cellules E. coli dnaK756 sont incapables de supporter l’ADN bactériophage λ. De plus, leur Hsp70 natif (DnaK) présente une activité ATPase élevée tout en démontrant une affinité réduite pour GrpE (facteur d’échange nucléotidique Hsp70). En conséquence, les cellules E. coli dnaK756 se développent correctement à des températures allant de 30 °C à 37 °C, mais elles meurent à des températures élevées (>40 °C). Pour cette raison, ces cellules servent de modèle pour étudier l’activité chaperonne de Hsp70. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’application de ces cellules afin de réaliser un test de complémentation, permettant d’étudier la fonction chaperonne in cellulo de Hsp70.
Introduction
Les protéines de choc thermique jouent un rôle important en tant que chaperons moléculaires en facilitant le repliement des protéines, en empêchant l’agrégation des protéines et en inversant le mauvais repliement des protéines 1,2. La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) est l’un des chaperons moléculaires les plus importants, jouant un rôle central dans l’homéostasie des protéines 3,4. DnaK est l’homologue5 d’E. coli Hsp70.
Divers tests biophysiques, biochimiques et cellulaires ont été mis au point pour explorer l’activité chaperonne de Hsp70 et pour dépister les inhibiteurs ciblant ce chaperon 6,7,8. Hsp70 est une protéine hautement conservée. Pour cette raison, plusieurs Hsp70 d’organismes eucaryotes, tels que Plasmodium falciparum (le principal agent du paludisme), ont été signalés comme substituant la fonction DnaK chez E. coli 6,9. De cette manière, un test de complémentation basé sur E. coli a été développé impliquant l’expression hétérologue de Hsp70s chez E. coli pour explorer leur fonction cytoprotectrice. En règle générale, ce test implique l’utilisation de cellules E. coli qui sont soit déficientes pour le DnaK, soit qui expriment un DnaK natif qui est fonctionnellement compromis. Bien que le DnaK ne soit pas essentiel à la croissance d’E. coli dans des conditions normales, il devient essentiel lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions stressantes telles que des températures élevées ou d’autres formes de stress10,11.
Les souches d’E. coli qui ont été développées pour étudier la fonction de Hsp70 à l’aide d’un test de complémentation comprennent E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr ::Tn10]) et E. coli dnaK756. Les cellules dnaK103 d’E. coli produisent un DnaK tronqué qui n’est pas fonctionnel, et en tant que tel, les cellules se développent correctement à 30 °C, tandis que la souche est sensible au stress dû au froid et à la chaleur12,13. De même, la souche E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA ::TcR Pdm1,1) ne se développe pas au-dessus de 40 °C14,15. La souche E. coli dnaK756 exprime un DnaK natif mutant (DnaK756) caractérisé par trois substitutions glycine-aspartate aux positions 32, 455 et 468, donnant lieu à des résultats protéostatiques compromis. Par conséquent, cette souche est résistante au bactériophage λ ADN14. De plus, E. coli dnaK756 présente une activité ATPase élevée, tandis que son affinité pour le facteur d’échange nucléotidique, GrpE, est réduite16. E. coli Les souches mutantes DnaK servent de modèles idéaux pour étudier l’activité chaperonne de Hsp70 par une approche de complémentation. Comme le DnaK n’est essentiel que dans des conditions stressantes, le test de complémentation est généralement effectué à des températures élevées (Figure 1). Parmi les avantages de l’utilisation d’E. coli pour cette étude, citons son génome bien caractérisé, sa croissance rapide et le faible coût de culture et d’entretien17.
Dans cet article, nous décrivons en détail un protocole impliquant l’utilisation de cellules E. coli dnaK756 pour étudier la fonction de Hsp70. Les Hsp70 que nous avons utilisés dans le test sont des DnaK de type sauvage et son dérivé chimérique, KPf (composé du domaine ATPase de DnaK fusionné au domaine de liaison au substrat C-terminal de Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F a été exprimé de manière hétérologue comme un contrôle négatif puisque la mutation l’empêche essentiellement de se lier aux substrats, abrogeant ainsi son activité chaperonne9.
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Protocol
1. Transformation
REMARQUE : Utilisez de la verrerie stérile pour la culture, des pointes de pipette et des milieux fraîchement préparés et autoclavés. Préparez des cultures de cellules d’E. coli dans 2x gélose tryptone de levure (YT) [1,6 % de tryptone (p/v), 1 % d’extrait de levure (p/v), 0,5 % de NaCl (p/v), 1,5 % de gélose (p/v)]. Les réactifs généraux utilisés dans le protocole et leurs sources sont indiqués dans la table des matières.
- Étiqueter les tubes de microcentrifugation de 2,0 mL et aliquote 50 μL de cellules E. coli dnaK756compétentes, en gardant les cellules sur la glace.
- Aux tubes de microcentrifugation de 2,0 mL avec des cellules compétentes, aliquote 10-50 ng d’ADN plasmidique pQE60/DnaK, pQE60/KPf et pQE60/KPf-V436F9 dans des tubes séparés.
- Conservez les tubes de microcentrifugation de 2,0 mL contenant les cellules compétentes et l’ADN plasmidique sur de la glace pendant 30 min.
- Secouez le mélange cellules-ADN compétent pendant 60 s à 42 °C et remettez les tubes de microcentrifugation sur la glace pendant 10 min.
- Ajouter 950 μL de bouillon frais 2x YT (pré-incubé à 37 °C) et incuber à 37 °C en agitant à 150 tours/min pendant 1 h. Laissez les cellules se développer beaucoup plus longtemps pour favoriser leur récupération si nécessaire.
REMARQUE : Évitez de secouer vigoureusement les cellules. - Pipeter 100 μL de cellules et les étaler sur 2 plaques de gélose YT contenant 50 μg/mL de kanamycine, 10 μg/mL de tétracycline pour la souche respective et 100 μg/mL d’ampicilline (voir le tableau des matériaux) pour la sélection des plasmides.
- Centrifuger le reste des cellules (dont le volume est maintenant d’environ 900 μL) pendant 1 min à 5000 x g (à 4 °C) à l’aide d’une microcentrifugeuse de paillasse.
- Décanter environ 800 μL du bouillon et utiliser le milieu restant pour remettre en suspension les cellules granulées.
- Plaquez les cellules récupérées sur la plaque de gélose 2x YT.
- Incuber les deux plaques de gélose pendant la nuit (ou environ 17 h) à 37 °C.
REMARQUE : Ces cellules se développent très lentement et peuvent avoir besoin d’être incubées beaucoup plus longtemps. Attention à repérer les colonies qui peuvent commencer très petites. La plaque contenant les cellules remises en suspension après centrifugation (étape 1.7) sert de secours au cas où l’efficacité de transformation des cellules serait faible, auquel cas les cellules granulées pourraient améliorer la récupération des cellules transformées. Cependant, si l’efficacité de la transformation est excellente, la plaque de gélose sur laquelle les cellules concentrées ont été plaquées peut être caractérisée par une culture envahie par la végétation lors de l’incubation, ce qui rend difficile l’identification de colonies individuelles. Dans ce cas, l’autre plaque de gélose peut être celle sur laquelle poussent des colonies bien espacées.
2. Placage cellulaire
- Prélever une seule colonie des transformants et l’inoculer dans 10 mL de 2 bouillons YT complétés par 50 μg/mL de kanamycine, 10 μg/mL de tétracycline pour la sélection des cellules E. coli dnaK756 et 100 μg/mL d’ampicilline pour la sélection des plasmides.
REMARQUE : Utiliser des fioles (≥50 ml) pour assurer l’aération lors de l’agitation de la culture. Incuber l’inoculum pendant une nuit (17 h) à 37 °C en agitant à 150 rotations/min. - Prenez une lecture d’absorbance àOD 600 le lendemain matin.
- Nettoyez la surface de l’établi en utilisant de l’éthanol à 75 % pour écouvillonner la surface en vue du repérage cellulaire.
- À l’aide d’un tube de microcentrifugation de 2 ml, standardiser la culture à une lecture OD600 de 2,0 en utilisant 2x bouillon YT.
REMARQUE : Assurez-vous que les lectures de diamètre extérieur sont prises correctement car cette étape est importante pour normaliser la densité cellulaire entre les différents échantillons. - À l’aide de tubes à microcentrifuger de 2 ml, préparer des dilutions en série des cellules de 100 à 10-5.
- Incuber les plaques de gélose à utiliser pour repérer les cellules dans un four réglé à 40 °C pour permettre aux plaques de sécher avec les couvercles partiellement ouverts pour assurer l’évacuation de la vapeur d’eau.
REMARQUE : Pour vous assurer que les cellules sont repérées à des distances uniformément séparées, tracez des lignes sur une feuille de papier sur laquelle un modèle de sites de repérage est imprimé. - Repérer 2 μL des cellules diluées en série sur les plaques de gélose complétées par 50 μg/mL de kanamycine, 10 μg/mL de tétracycline, 100 μg/mL d’ampicilline et 0,5 mM d’IPTG (pour l’induction de l’expression des protéines recombinantes) (voir le tableau des matériaux).
- Placer chaque échantillon sur deux plaques distinctes (l’une à incuber à 37 °C et l’autre à 43,5 °C).
REMARQUE : Évitez de percer la plaque de gélose. - Placer les échantillons témoins sur la même plaque que les échantillons expérimentaux pour minimiser les effets sur l’environnement.
- Effectuez le repérage rapidement pour vous assurer que le processus est terminé avant que les cellules ne commencent à se développer, car cela peut générer des schémas de croissance asymétriques.
REMARQUE : Il est important d’éviter les aérosols lors des taches, car ils contamineraient les plaques. Il est également important de garder les plaques fermées entre les taches pour éviter la contamination. - Incuber une plaque à 37 °C (température de croissance permissive) et l’autre à la température de croissance non permissive de 43,5 °C.
REMARQUE : Incuber les plaques à l’envers pour éviter que la vapeur ne s’accumule sur le couvercle, car l’eau condensée entraînerait les colonies tachetées de leur position. - Placez toutes les plaques dans les incubateurs en même temps et évitez d’ouvrir l’incubateur jusqu’au lendemain matin.
REMARQUE : Il est déconseillé d’ouvrir la porte de l’incubateur plusieurs fois pendant l’incubation des plaques. En effet, l’accès de l’air dans l’incubateur peut entraîner des fluctuations de température qui ont un impact négatif sur la croissance cellulaire.
3. Confirmation de l’expression des protéines recombinantes
- À l’aide d’une boucle stérile, prélevez une partie des cellules restantes de la même colonie de cellules E. coli dnaK756 transformées.
- Inoculer les cellules dans 10 mL de bouillon YT complété par 50 μg/mL de kanamycine, 10 μg/mL de tétracycline et 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber pendant une nuit (17 h) à 37 °C en agitant à 150 tours/min.
- Transférer la culture dans 90 mL de bouillon stérile 2x YT contenant les antibiotiques nécessaires comme mentionné à l’étape 3.2. Laissez les cellules croître jusqu’à la phase mi-log (OD600 = 0,4-0,6).
- Prélever 2 mL de culture d’échantillon avant l’induction (0 h d’échantillon d’induction).
- Ajouter IPTG à une concentration finale de 1 mM pour induire la production de protéines et réincuber les cellules à 37 °C.
- Prélever un deuxième échantillon de 2 mL 6 h après l’induction.
- Récolter les cellules par centrifugation à 5000 x g pendant 10 min. Maintenez la température de la centrifugeuse à 4 °C.
- Jetez le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans un tampon PBS (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) et stocker à -20 °C.
4. Analyses SDS-PAGE et western blot
- Préparez 2 gels SDS à 10 % comme décrit précédemment19.
- Conservez l’un des gels SDS-PAGE pour une coloration ultérieure à l’aide de la coloration Coomassie pour visualiser les bandes de protéines. Utilisez le deuxième gel SDS-PAGE pour effectuer l’analyse par transfert Western.
- Aliquote 80 μL des échantillons remis en suspension et mélangez-les avec 20 μL de 4 tampons de chargement Laemmli SDS.
- Faire bouillir la suspension à 100 °C pendant 10 min. Chargez ensuite 10 μL de chaque échantillon sur le gel SDS préfabriqué (voir tableau des matériaux).
- Effectuer l’électrophorèse à température ambiante pendant 1 h en utilisant une tension de 120 V dans une solution 1x de tampon de fonctionnement SDS (25 mm Tris, 250 mm glycine, 0,1 % (p/v) SDS).
- Teindre le gel avec la coloration Coomassie (voir tableau des matériaux) pendant 1 h, puis décolorer avec un tampon de décoloration (50 % (v/v) de méthanol, 10 % (v/v) d’acide acétique dans de l’eau distillée) pendant 2 h.
- Visualisez les bandes protéiques présentes dans le gel à l’aide d’un système d’imagerie sur gel (voir Tableau des matériaux). Relancez un autre gel SDS-PAGE avec les mêmes échantillons en suivant le protocole mentionné ci-dessus.
- À la fin de l’électrophorétique, prendre des gels SDS-PAGE pour effectuer l’analyse par transfert Western comme décrit précédemment19.
- Laver la membrane de nitrocellulose sur laquelle les protéines ont été transférées trois fois dans un tampon de lavage (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
- Utilisez α-DnaK (voir Tableau des matériaux) pour détecter DnaK et α-PfHsp70-17 pour détecter KPf et son mutant, KPf-V436F), respectivement.
- Utiliser les anticorps à une dilution de 1:2000 dans du lait écrémé à 5 %. Incuber à 4 °C en agitant à 60 tours/min pendant 1 h.
- Éliminer les anticorps non spécifiquement liés en lavant la membrane de nitrocellulose dans TBS-Tween 3 fois en 15 minutes.
- Incuber la membrane dans l’anticorps secondaire (α-lapin, voir tableau des matériaux) dans les mêmes conditions que l’étape précédente. Ceci est suivi d’un lavage ultérieur dans les mêmes conditions que l’anticorps primaire.
- Résoudre les bandes à l’aide d’un réactif de détection de chimiluminescence améliorée (ECL).
- Visualisez les bandes à l’aide d’un imageur gel.
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Representative Results
La figure 2 présente une image de la gélose scannée contenant des cellules qui ont été repérées et cultivées à la température de croissance permissive de 37 °C et 43,5 °C, respectivement. Sur le côté droit de la figure 2, les composantes du transfert Western excisées représentent l’expression de DnaK, KPf et KPf-V436F dans les cellules dnaK756 d’E. coli. Comme prévu, toutes les cellules E. coli dnaK756 cultivées à la température de croissance permissive de 37 °C ont réussi à se développer. Cependant, dans les conditions de croissance non permissives de 43,5 °C, seules les cellules exprimant de manière hétérologue DnaK et KPf ont réussi à se développer, comme indiqué précédemment 6,9,20 (Figure 2). D’autre part, les cellules exprimant KPf-V436F ne se sont développées qu’à 37 °C mais n’ont pas réussi à croître à 43,5 °C. Cela démontre que DnaK et KPf ont pu restaurer le défaut de croissance des cellules E. coli dnaK756 dans des conditions de stress thermique. L’incapacité des cellules exprimant de manière hétérologue KPf-V436F à soutenir la croissance des cellules à 43,5 °C démontre l’absence de fonction chaperonne de cette protéine. À cet égard, KPf-V436F sert de protéine de contrôle négatif idéale.
Figure 1 : Principe du test de complémentation utilisant des cellules E. coli dnaK756 pour étudier la fonction chaperon des protéines exprimées de manière hétérologue. E. coli dnaK756 exprime une protéine native DnaK756 qui est incapable de protéger les cellules contre le stress thermique. L’introduction de Hsp70 hétérologue fonctionnel sauve les cellules de la mort lors de l’exposition au stress thermique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Essai sur plaque de complémentation démontrant les capacités de DnaK et KPf à protéger les cellules E. coli dnaK756 contre le stress thermique. Les cellules transformées ont été cultivées à 37 °C (température de croissance permissive) et 43,5 °C (température de croissance non permissive). Les cellules ont été standardisées et plaquées en dilutions en série. « N » symbolise « Soigné », représentant la première tache composée de cellules non diluées. À l’extrême droite se trouvent les excisions par transfert Western représentant l’expression des trois protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole démontre l’utilité des cellules E. coli dnaK756dans l’exploration de la fonction chaperon de Hsp70 exprimée de manière hétérologue. Ce test pourrait être adopté pour cribler les inhibiteurs ciblant la fonction de Hsp70 dans le cellulo. Cependant, l’une des limites de cette méthode est que les Hsp70 incapables de remplacer le DnaK dans E. coli ne sont pas compatibles avec ce test. L’absence de modification post-traductionnelle21 de certains Hsp70 non natifs peut expliquer leur manque de fonction dans le système E. coli . Un essai de complémentation à base de levure22 peut combler certaines des lacunes de l’essai à base d’E. coli.
Plusieurs étapes clés sont cruciales pour garantir des résultats reproductibles. Il s’agit notamment de s’assurer que seules les cellules transformées par la construction plasmidique respective sont utilisées pendant le placage. De plus, il est important d’éviter la contamination de la culture tout au long des étapes. De plus, comme les cellules DnaK d’E. coli stressées sont sensibles à une filamentation excessive10, il est important d’éviter les secousses vigoureuses pendant la culture, car cette contrainte physique favorise une filamentation étendue. Les cellules excessivement filamentées donnent des lectures de croissance faussement apparente plus élevées à OD600, ce qui entraîne une surestimation de la croissance de la culture et un impact négatif sur la standardisation des cellules avant le placage. Bien que Hsp70 ne soit pas essentiel à la croissance d’E. coli dans des conditions normales, les cellules dépourvues de cette protéine sont sensibles au stress10. Pour cette raison, les cellules E. coli dnaK756 se développent beaucoup plus lentement après avoir été transformées ou lors de leur récupération des stocks de glycérol. De plus, ils sont extrêmement sensibles aux fluctuations de température. Par conséquent, il est important d’éviter d’ouvrir la porte de l’incubateur une fois que les plaques de gélose plaquées sont placées à l’intérieur jusqu’à ce qu’il soit temps de voir les plaques.
Les données du western blot sont importantes pour confirmer l’expression des protéines recombinantes Hsp70 respectives dans les cellules E. coli dnaK756. L’échec de l’expression de la protéine respective conduit à un résultat faussement négatif pour les cellules se développant à une température de croissance non permissive.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Les travaux ont été soutenus par une subvention obtenue du Centre international pour le génie génétique et la biotechnologie (ICGEB) numéro de subvention HDI/CRP/012, Direction de la recherche de l’Université de Venda, subvention I595, Département de la science et de l’innovation (DSI) et Fondation nationale de la recherche (NRF) d’Afrique du Sud (numéros de subvention, 75464 et 92598) accordée à AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
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