Summary
Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.
Abstract
Apresentamos um método para incorporar em vesículas redes complexas de proteínas, envolvendo proteínas integrais de membrana, enzimas e sensores baseados em fluorescência, usando componentes purificados. Este método é relevante para o projeto e construção de biorreatores e o estudo de redes complexas de reações metabólicas fora de equilíbrio. Começamos reconstituindo (múltiplas) proteínas de membrana em grandes vesículas unilamelares (LUVs) de acordo com um protocolo desenvolvido anteriormente. Em seguida, encapsulamos uma mistura de enzimas purificadas, metabólitos e sensores baseados em fluorescência (proteínas fluorescentes ou corantes) por meio de congelamento-descongelamento-extrusão e removemos componentes não incorporados por centrifugação e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. O desempenho das redes metabólicas é medido em tempo real monitorando a relação ATP / ADP, concentração de metabólitos, pH interno ou outros parâmetros por leitura de fluorescência. Nossas vesículas contendo proteínas de membrana de 100-400 nm de diâmetro podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs), usando procedimentos existentes, mas otimizados. A abordagem permite a inclusão de componentes solúveis (enzimas, metabólitos, sensores) em vesículas de tamanho micrométrico, aumentando assim o volume dos biorreatores em ordens de magnitude. A rede metabólica contendo GUVs é aprisionada em dispositivos microfluídicos para análise por microscopia óptica.
Introduction
O campo da biologia sintética de baixo para cima concentra-se na construção de células (mínimas) 1,2 e biorreatores metabólicos para fins biotecnológicos 3,4 ou biomédicos 5,6,7,8. A construção de células sintéticas fornece uma plataforma única que permite aos pesquisadores estudar proteínas (de membrana) em condições bem definidas, imitando as de ambientes nativos, permitindo a descoberta de propriedades emergentes e funções bioquímicas ocultas de proteínas e redes de reação9. Como um passo intermediário em direção a uma célula sintética que funciona de forma autônoma, são desenvolvidos módulos que capturam características essenciais das células vivas, como conservação de energia metabólica, síntese de proteínas e lipídios e homeostase. Esses módulos não apenas aprimoram nossa compreensão da vida, mas também têm aplicações potenciais nos campos da medicina8 e da biotecnologia10.
As proteínas transmembranares estão no centro de praticamente qualquer rede metabólica, pois transportam moléculas para dentro ou para fora da célula, sinalizam e respondem à qualidade do ambiente e desempenham vários papéis biossintéticos. Assim, a engenharia de módulos metabólicos em células sintéticas requer, na maioria dos casos, a reconstituição de proteínas integrais e/ou periféricas da membrana em uma bicamada de membrana composta por lipídios específicos e de alta integridade (baixa permeabilidade). O manuseio dessas proteínas de membrana é desafiador e requer conhecimentos específicos e habilidades experimentais.
Vários métodos foram desenvolvidos para reconstituir proteínas de membrana dentro de vesículas fosfolipídicas, na maioria das vezes com o objetivo de estudar a função11,12, regulação13, propriedades cinéticas14,15, dependência lipídica15,16 e/ou estabilidade17 de uma proteína específica. Esses métodos envolvem a rápida diluição da proteína solubilizada em detergente em meio aquoso na presença de lipídios18, a remoção de detergentes pela incubação de proteínas solubilizadas em detergente com vesículas lipídicas desestabilizadas por detergente e a absorção do(s) detergente(s) em esferas de poliestireno19, ou a remoção de detergentes por diálise ou cromatografia de exclusão de tamanho20. Solventes orgânicos têm sido usados para formar vesículas lipídicas, por exemplo, através da formação de interfases óleo-água21, mas a maioria das proteínas integrais da membrana são inativadas quando expostas a esses solventes.
Em nosso laboratório, reconstituímos principalmente proteínas de membrana pelo método de absorção de detergente para formar grandes vesículas unilamelares (LUVs) 19 . Esse método permite a co-reconstituição de múltiplas proteínas de membrana e a encapsulação no lúmen da vesícula de enzimas, metabólitos e sondas22,23. As LUVs contendo proteínas de membrana podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) com/sem encapsulamento de componentes solúveis em água, usando eletroformação24 ou inchaço assistido por gel25 e condições específicas para preservar a integridade das proteínas de membrana26.
Este trabalho apresenta um protocolo para a reconstituição em LUVs de uma rede metabólica fora de equilíbrio que regenera ATP através da quebra de L-arginina em L-ornitina27. A formação de ATP está associada à produção de glicerol-3-fosfato (G3P), um importante bloco de construção para a síntese de fosfolipídios22,28. A via metabólica consiste em duas proteínas integrais da membrana, uma arginina/ornitina (ArcD) e um antiportador G3P/Pi (GlpT). Além disso, três enzimas solúveis (ArcA, ArcB, ArcC) são necessárias para a reciclagem de ATP, e GlpK é usado para converter glicerol em glicerol 3-fosfato, usando o ATP da quebra de L-arginina, consulte a Figura 1 para uma visão geral esquemática da via. Este protocolo representa um bom ponto de partida para a futura construção de redes de reação ainda mais complexas - para a síntese de lipídios ou proteínas ou a divisão de células. A composição lipídica das vesículas suporta a atividade de uma ampla variedade de proteínas integrais da membrana e foi otimizada para o transporte de diversas moléculas para dentro ou para fora das vesículas 27,29,30.
Figura 1: Visão geral da via de produção de ATP e síntese e excreção de glicerol 3-fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em suma, proteínas de membrana purificadas (solubilizadas em dodecil-β-D-maltosídeo, DDM) são adicionadas a vesículas lipídicas pré-formadas que foram desestabilizadas com Triton X-100, o que permite a inserção das proteínas na membrana. As moléculas de detergente são subsequentemente (lentamente) removidas pela adição de esferas de poliestireno ativadas, resultando na formação de proteolipossomas bem selados. Os componentes solúveis podem então ser adicionados às vesículas e encapsulados por meio de ciclos de congelamento e descongelamento, que prendem as moléculas no processo de fusão da membrana. As vesículas obtidas são altamente heterogêneas e muitas são multilamelares. Eles são então extrudados através de um filtro de policarbonato com um tamanho de poro de 400, 200 ou 100 nm, o que produz vesículas de tamanho mais uniforme; Quanto menor o tamanho dos poros, mais homogêneas e unilamelares são as vesículas, mas ao preço de um volume interno menor. As proteínas não incorporadas e as pequenas moléculas são removidas da solução externa por cromatografia de exclusão por tamanho. Os proteoLUVs podem ser convertidos em vesículas de tamanho micrométrico por inchaço assistido por gel, e esses proteoGUVs são então coletados e presos em um chip microfluídico para caracterização e manipulação microscópica. A Figura 2 mostra uma visão geral esquemática do protocolo completo.
Figura 2: Visão geral do protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (LUVs) e micrométrico (GUVs). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os protocolos de reconstituição e encapsulamento funcionam bem e a funcionalidade das proteínas é mantida, mas os proteoLUVs e proteoGUVs são heterogêneos em tamanho. As abordagens microfluídicas31,32 permitem a formação de vesículas do tamanho de micrômetros que são mais homogêneas em tamanho, mas a reconstituição funcional das proteínas da membrana geralmente não é possível porque o solvente residual na bicamada inativa as proteínas. Os proteoLUVs variam em tamanho de 100 a 400 nm e, em baixas concentrações de enzimas, o encapsulamento pode levar a vesículas com vias metabólicas incompletas (efeitos estocásticos; ver Figura 3). Os LUVs são ideais para a construção de módulos metabólicos específicos, como mostrado aqui para a produção de ATP e blocos de construção como G3P. Tais proteoLUVs podem potencialmente ser encapsulados em GUVs e servir como compartimentos semelhantes a organelas para as vesículas hospedeiras.
Figura 3: Número de moléculas por vesícula com diâmetro de 100, 200 ou 400 nm. (A) Quando as proteínas encapsuladas (enzimas, sondas) estão na faixa de 1-10 μM. (B) A reconstituição é feita em 1 a 1.000, 1 a 10.000 e 1 a 100.000 proteínas de membrana por lipídio (mol / mol). Assumimos que as moléculas são encapsuladas nas concentrações indicadas e incorporadas na membrana nessas proporções proteína-lipídio. Para algumas enzimas, vimos que elas se ligam às membranas, o que pode aumentar sua concentração aparente nas vesículas. Abreviatura: LPR = Proporção Lipídio-Proteína Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Preparação geral
- Produtos químicos
- Dissolver os lípidos (em pó) a 25 mg/ml em CHCl3 para a produção de lipossomas pré-formados.
NOTA: É preferível preparar estoques de lipídios frescos, mas as soluções de estoque também podem ser armazenadas a -20 °C por algumas semanas. Trabalhar com lipídios na forma de pó é mais preciso do que usar lipídios já solubilizados em CHCl3. O CHCl3 deve ser manuseado com pipetas e/ou seringas de vidro e armazenado em recipientes de vidro, pois o CHCl3 dissolve os plásticos. - Dissolva pequenas moléculas (nucleótidos, aminoácidos, sondas de fluorescência) para o procedimento de encapsulamento em KPi a 50 mM (tampão A, ver quadro 1) e ajuste o pH para 7,00 ± 0,01. Dissolva o MgCl2 em água deionizada para evitar a formação de precipitados de fosfato de magnésio.
NOTA: As soluções de reserva podem ser armazenadas a -20 °C durante algumas semanas, com excepção da TDT, que é preparada na hora no dia da experiência. - Dissolva os ionóforos (por exemplo, valinomicina, nigericina) em DMSO ou EtOH a uma concentração de estoque de 100-500 μM. Armazene a -20 ° C por algumas semanas; Evite a evaporação.
NOTA: O DMSO não é volátil e, portanto, preferido ao EtOH. Use vidro em vez de frascos de plástico para evitar a adesão dos ionóforos à superfície dos frascos.
- Dissolver os lípidos (em pó) a 25 mg/ml em CHCl3 para a produção de lipossomas pré-formados.
- Buffers
- Prepare tampões frescos no dia do experimento (Tabela 1). Não armazene por mais de 24 horas.
- Purificação de proteínas solúveis
- Express ArcA, ArcB, ArcC (usamos uma variante específica chamada ArcC1), PercevalHR e GlpK conforme descrito anteriormente 27,28,33. Certifique-se de adicionar 10% de glicerol v / v ao tampão de lise celular, o que aumenta a estabilidade das proteínas. Purifique as proteínas solúveis conforme descrito 27,28,33 e brevemente relatado a seguir.
- Descongele 10 mL de lisado celular (~ 5 g de peso úmido) em um banho de água gelada. Enquanto isso, aplique 2 mL (1 CV) de resina de Ni2+-Sepharose em uma coluna de fluxo por gravidade (capacidade de 20 mL) com água deionizada (12 CVs) e tampão B (4 CVs) para lavar. Transfira o lisado descongelado para o gelo; trabalhar no gelo, salvo indicação em contrário.
- Adicionar imidazol ao lisado descongelado até uma concentração final de 10 mM e, em seguida, deitar a solução na coluna de fluxo por gravidade. Incubar durante 1 hora a 4 °C com nutação suave.
- Após 1 h, descarte o fluxo e lave a resina com tampão C (20 CVs).
- Eluir a proteína com tampão D. Use 60% CV para a primeira etapa de eluição, seguida por 4-6 etapas de 40% CVs.
- Determinar a concentração de proteínas e adicionar Na-EDTA a uma concentração final de 5 mM.
- Centrifugar a proteína purificada numa centrífuga de mesa refrigerada (velocidade máxima, 10 minutos, 4 °C). Purificar por cromatografia de exclusão de tamanho usando o tampão E. Agrupar as frações de eluição e concentrá-las a ~ 10 mg / mL com um filtro de concentração com um corte de 30 kDa. Preparar alíquotas de tamanho adequado (~ 20 μL), congelar rapidamente com azoto líquido e conservar a -80 °C para utilização posterior.
NOTA: É importante concentrar as enzimas a 50-100 μM para minimizar o volume necessário para o encapsulamento.
- Purificação de proteínas de membrana
- Superexpressar ArcD e GlpT conforme descrito anteriormente 22,27,33. Certifique-se de adicionar 10% de glicerol v / v ao tampão de lise celular; para purificação de ArcD, inclua 2 mM de agente redutor (por exemplo, DTT) no tampão. Purificar as proteínas marcadas com afinidade por cromatografia de Ni2+-Sepharose.
- Descongelar uma alíquota de vesículas de membrana bruta (10-20 mg de proteína total da membrana) em banho de água gelada.
NOTA: Depois de descongelado, trabalhe sempre no gelo, salvo indicação em contrário. Consulte a Tabela 1 para obter os buffers usados nesta seção. - Adicione as vesículas de membrana ao tampão F (ArcD) ou tampão G (GlpT) a um volume final de 6 mL. Incubar a amostra durante 1 h a 4 °C com nutação suave.
- Separar as proteínas de membrana solubilizadas dos detritos de membrana por ultracentrifugação (337.000 × g, 30 min, 4 °C). Enquanto isso, aplique 0,25 mL (1 CV) de resina de Ni2+-Sepharose em uma coluna de fluxo por gravidade (capacidade de 10 mL) com água deionizada (40 CVs) e 20 CVs de tampão H (ArcD) ou tampão I (GlpT).
- Despejar a proteína solubilizada na coluna de fluxo por gravidade e adicionar imidazol até uma concentração final de 10 mM. Incubar durante 1 h a 4 °C com nutação suave.
- Após 1 h, descarte o fluxo e lave a resina com 20 CVs de Buffer J (ArcD) ou Buffer K (GlpT).
- Eluir a proteína de membrana em etapas de 60% CV (1st) e 40% CV (2nd-6 th) com Buffer L (ArcD) ou Buffer M (GlpT).
- Determine a concentração de proteínas e prossiga para a secção 2.2. para reconstituição da membrana.
NOTA: A purificação por exclusão de tamanho não é necessariamente realizada para proteínas de membrana, uma vez que a reconstituição da membrana produz uma purificação semelhante. As etapas 1.4 e 2.2 podem ser executadas em 1 dia de trabalho. Comece com a purificação da proteína (passo 1.4) de manhã e continue com a reconstituição (passo 2.2) à tarde. A reconstituição termina no dia seguinte (ver secção 2.2 para mais informações). PONTO DE PARADA: ArcD e GlpT purificados e solublizados por DDM podem ser armazenados a -80 oC para uso posterior, mas isso não é verdade para todas as proteínas de membrana. Preparar alíquotas de tamanho adequado (50-200 μL), congelar rapidamente com azoto líquido e conservar a -80 °C para utilização posterior. Essas proteínas são ativas por vários meses quando armazenadas a -80 °C na presença de 10% v/v de glicerol.
- Descongelar uma alíquota de vesículas de membrana bruta (10-20 mg de proteína total da membrana) em banho de água gelada.
- Superexpressar ArcD e GlpT conforme descrito anteriormente 22,27,33. Certifique-se de adicionar 10% de glicerol v / v ao tampão de lise celular; para purificação de ArcD, inclua 2 mM de agente redutor (por exemplo, DTT) no tampão. Purificar as proteínas marcadas com afinidade por cromatografia de Ni2+-Sepharose.
- Preparação de β-caseína para fins de passivação
- Ressuspenda 100 mg de β-caseína em 20 mL de água deionizada e titule com 1 M NaOH até que a β-caseína esteja completamente dissolvida. Em seguida, adicione ácido acético 1 M para ajustar o pH para 7,0 e encha o volume para 50 mL com água deionizada. Filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm e fazer alíquotas de 500 μl.
NOTA A β-caseína pode ser armazenada a -20 °C durante 6 meses. Recomenda-se filtrar a β-caseína novamente antes do uso para evitar que os agregados de β-caseína entupam o chip microfluídico.
- Ressuspenda 100 mg de β-caseína em 20 mL de água deionizada e titule com 1 M NaOH até que a β-caseína esteja completamente dissolvida. Em seguida, adicione ácido acético 1 M para ajustar o pH para 7,0 e encha o volume para 50 mL com água deionizada. Filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm e fazer alíquotas de 500 μl.
| Buffer | Composição | ||
| Buffer A | 50 mM KPi pH 7,0 | ||
| Buffer B | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerol, 10 mM imidazol, pH 7,5 | ||
| Buffer C | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerol, 50 mM imidazol, pH 7,5 | ||
| Tampão D | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerol, 500 mM imidazol, pH 7,5 | ||
| Tampão E | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerol, pH 7,0 | ||
| Amortecedor F | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5% p/v DDM, 10% v/v glicerol, 2 mM β-mercaptoetanol, pH 7,5 | ||
| Buffer G | Tris-HCl 50 mM, DDM a 0,5%, glicerol a 20% v/v, pH 8 | ||
| Tampão H | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02% p/v DDM, 10% v/v glicerol, 2 mM β-mercaptoetanol, 10 mM imidazol, pH 7,5 | ||
| Amortecedor I | Tris-HCl 50 mM, DDM 0,04% p/v, glicerol 20% v/v, imidazol 10 mM, pH 8,0 | ||
| Tampão J | 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% p/v DDM, 10% v/v glicerol, 2 mM β-mercaptoetanol, 50 mM imidazol, pH 7,5 | ||
| Tampão K | Tris-HCl 50 mM, DDM 0,04% p/v, glicerol 20% v/v, imidazol 50 mM, pH 8 | ||
| Tampão L | 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% p/v DDM, 10% v/v glicerol, 2 mM β-mercaptoetanol, 500 mM imidazol, pH 7,5 | ||
| Tampão M | Tris-HCl 50 mM, DDM a 0,04% p/v, glicerol a 20% v/v, imidazol 500 mM, pH 8 | ||
| Tampão M | 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0 | ||
| Tampão O | 50 mM KPi, 0,5 mM de L-ornitina, 10 mM de Na-ADP, 10 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, pH 7,0 | ||
| Tampão P | 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM glicose (x é variado para corresponder à osmolaridade do meio externo e interno) | ||
| Buffer Q | 50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM Sacarose, 2 mM DTT | ||
| Tampão R | 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginina, x mM de glicose | ||
Tabela 1: Buffers usados neste protocolo.
2. Proteoliposas: reconstituição de proteínas de membrana purificadas em vesículas lipídicas pré-formadas
- Dia 1
- Preparação de vesículas lipídicas pré-formadas
- Escolha a composição lipídica (por exemplo, fosfolipídios sintéticos, lipídios polares de E. coli ) com base nas necessidades das proteínas da membrana.
NOTA: Uma mistura de DOPE, DOPG e DOPC (25:25:50 mol%) é um bom ponto de partida, mas esteróis ou cardiolipina podem ser necessários para algumas proteínas; Para proteínas da membrana plasmática de levedura, incluímos lipídios palmitoil-oleoíla em vez de dioleoíla30. Uma mistura de dope, dopg e DOPC (25:25:50 mol%) é suficiente para a reconstituição de ArcD e GlpT. - Misturar os lípidos desejados (solubilizados em CHCl3) e evaporar o CHCl3 num evaporador rotativo até formar uma película lipídica. Lave os lipídios adicionando éter dietílico em volume igual ao CHCl3. Evaporar o éter dietílico e obter uma película lipídica seca.
- Ressuspenda o filme lipídico para 20 mg / mL de lipídios totais em meio aquoso (tampão A). Comece com metade do volume total e agite suavemente; Em seguida, transfira cuidadosamente os lipídios para um tubo ou frasco limpo de tamanho adequado. Adicionar o tampão A novo ao balão e repetir o procedimento para dissolver os lípidos restantes e transferi-los para um novo recipiente. Adicione tampão A adicional para atingir uma concentração final de 20 mg / mL.
- Sonicar os lipídios ressuspensos usando um sonicador de sonda. Use os seguintes parâmetros para uma ponta de sonicador com um diâmetro de 6 mm: intensidade de 4 μm, amplitude de 70%, 5 s ligado, 45 s desligado, 16 ciclos. Mergulhe os lipídios em um banho de água gelada contendo EtOH para evitar superaquecimento por sonicação.
- Congele rapidamente a amostra sonicada (volume de 40 mL em um tubo de centrífuga de 50 mL) em nitrogênio líquido e descongele a amostra em banho-maria à temperatura ambiente. Repita uma vez; em seguida, alíquota dos lipossomas nos volumes desejados (por exemplo, 1 mL ou 20 mg de lipídios totais em um tubo de plástico de 1,5 mL).
PONTO DE PARADA: O procedimento pode ser interrompido neste ponto. Congelar rapidamente cada alíquota mais uma vez (terceiro ciclo) e conservar em azoto líquido durante alguns meses. Tome cuidado para perfurar as tampas do tubo duas vezes com uma agulha para evitar a explosão do tubo após a fervura rápida do nitrogênio líquido.
- Escolha a composição lipídica (por exemplo, fosfolipídios sintéticos, lipídios polares de E. coli ) com base nas necessidades das proteínas da membrana.
- Preparação de vesículas lipídicas pré-formadas
- Dia 2
- Reconstituição de proteínas de membrana purificadas em lipossomas pré-formados
- Descongelar uma alíquota de lipossomas (20 mg de lípidos totais) em banho-maria à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare uma extrusora aplicando um filtro de sua escolha (por exemplo, policarbonato, diâmetro de poro de 400 nm); pré-equilibrar a extrusora com o Buffer A; e carregue os lipossomas descongelados ('solução leitosa') na extrusora e passe-os 13x pelo filtro. Colete os lipossomas extrudados (agora grandes vesículas unilamelares; "solução opaca") em um recipiente de vidro ou plástico de tamanho adequado (por exemplo, 15 mL). Dilua os lipossomas para 4 mg / mL com tampão A suplementado com 2 mM de DTT.
- Transfira 1 mL de lipossomas de 4 mg / mL para uma cubeta transparente de 1 mL. Num espectrofotómetro, medir a densidade óptica inicial a 540 nm. Despeje a amostra medida de volta e adicione 50 μL de Triton X-100 a 10% v / v aos lipossomas.
NOTA: Um volume de titulação de 50 μL de 10% Triton-X100 é adequado para 20 mg de lipídios em um volume de 5 mL; a adição de Triton X-100 diluirá os lipídios em ~ 5%. Ajuste o volume de titulação ao trabalhar com diferentes quantidades de lipossomas. Para sinais de densidade óptica estáveis, titule os lipossomas com Triton X-100 à temperatura ambiente. - Repita a etapa 2.2.1.2 e observe quando uma densidade óptica máxima for atingida (Rsat). Prossiga com a titulação até atingir uma densidade óptica de aproximadamente 60% Rsat (Figura 4). Despeje as vesículas desestabilizadas com detergente de volta no tubo de vidro / plástico (o volume final agora é de aproximadamente 5,2 mL), transfira a amostra para o gelo e deixe esfriar.
- Adicione a(s) proteína(s) de membrana purificada(s) aos lipossomas desestabilizados para atingir a proporção lipídio-proteína desejada (p/p). Use uma proporção de 400:1 até 100:1 p/p; uma vez que ArcD e GlpT têm pesos moleculares de ~ 55 kDa, uma proporção lipídio-proteína de 400: 1 p / p corresponde a ~ 30.000 lipídios por proteína e ~ 50 moléculas de ArcD e GlpT cada uma por vesículas com um diâmetro de 400 nm.
NOTA: Aqui usamos 400:1 p/p, correspondendo a 50 μg de cada proteína por 20 mg de lipídios. - Nute as amostras a 4 °C por 15 min para permitir que as proteínas da membrana se insiram na membrana lipossomal desestabilizada.
- Para remover o detergente, adicione 200 mg de esferas de poliestireno seco, preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Nutate a 4 °C por mais 15 min.
NOTA: Uma quantidade de 200 mg de grânulos secos é adequada para 20 mg de lipídios, mas deve ser ajustada quando um tamanho de amostra diferente é usado. - Repita a etapa 2.2.1.6 2x, para um total de três adições de grânulos de poliestireno. Em seguida, incubar durante a noite a 4 °C com nutação suave.
- Reconstituição de proteínas de membrana purificadas em lipossomas pré-formados
- Dia 3
- Repita a etapa 2.2.1.6; no entanto, desta vez, nutato a 4 °C durante 1 h.
- Prenda uma coluna de fluxo de gravidade vazia (capacidade de 10 mL) acima de um tubo de ultracentrifugação vazio de 6.5 mL no gelo. Despeje a amostra na coluna e colete os proteolipossomas no tubo de ultracentrifugação (os grânulos são retidos na coluna).
- Lave os grânulos com 0,5 mL de tampão A suplementado com 2 mM de DTT e colete o filtrado no tubo de ultracentrifugação.
- Concentrar os proteolipossomas por ultracentrifugação (337.000 × g, 30 min, 4 oC). Ressuspenda os proteolipossomas em um volume total de 200 μL (100 mg de lipídio / mL) em tampão A suplementado com 2 mM de DTT; o volume seco das vesículas após a centrifugação é de ~ 40 a 120 μL27. Dividido em alíquotas do tamanho desejado (por exemplo, três alíquotas de 6,66 mg de lipídios totais).
NOTA: O tamanho da alíquota é arbitrário, mas afetará o tamanho do pellet em etapas posteriores (consulte a etapa 3.2.3.1). PONTO DE PARADA: O procedimento pode ser interrompido aqui. Congele rapidamente cada alíquota e armazene em nitrogênio líquido por até algumas semanas. Tome cuidado para perfurar as tampas dos tubos duas vezes com uma agulha para evitar a explosão do tubo após a fervura rápida do nitrogênio líquido.
Figura 4: Titulação de lipossomas pré-formados com Triton X-100. Os lipossomas a 5 mg de lipídios / mL são extrudados através de um filtro de policarbonato (400 nm) em 50 mM KPi (pH 7,0) e, em seguida, titulados com Triton X-100 (etapa do protocolo 2.2.1.2). A turbidez das vesículas é medida em A540. A seta indica a concentração de Triton X-100 na qual as vesículas são suficientemente desestabilizadas para a inserção espontânea de proteínas de membrana, conforme descrito em19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Encapsulamento de uma rede metabólica para reciclagem de ATP e síntese de glicerol 3-P em vesículas de tamanho submicrônico
- Dia 1
- Mistura de componentes
- Para um encapsulamento padrão, use 66,6 μL de proteolipossomas em um volume final de 200 μL (33,33 mg / mL de lipídios totais). Calcule o volume de cada componente (enzima, cofator) necessário para atingir a concentração desejada, adicione esses componentes aos proteolipossomas e ajuste o volume para 200 μL com o tampão A (Tabela 2).
NOTA: A concentração de proteína pode ser ajustada com base na configuração experimental. No entanto, deve-se tomar cuidado para que várias cópias (>10) de cada enzima estejam em média presentes por vesícula, para evitar efeitos estocásticos indesejados. Concentrações > 1 μM são geralmente seguras; 1 μM em uma vesícula com diâmetro de 400 nm corresponde a aproximadamente 20 cópias (Figura 3). - Pipete o tampão A em um tubo vazio de 1,5 mL e adicione DTT, Na-ADP, MgCl2, L-ornitina (e piranina, se necessário para medições internas de pH). Em seguida, adicione as enzimas e misture delicadamente. Adicione a solução sobre os proteolipossomas pré-formados e faça um vórtice breve em baixa velocidade.
NOTA: É importante adicionar Na-ADP antes do MgCl2 para evitar a formação indesejada de precipitados de fosfato de magnésio. O vórtice é necessário para a mistura adequada da solução viscosa; no entanto, minimize a duração e a velocidade para evitar danos mecânicos às proteínas. PercevalHR e piranina não podem ser co-encapsulados porque seus espectros se sobrepõem.
- Para um encapsulamento padrão, use 66,6 μL de proteolipossomas em um volume final de 200 μL (33,33 mg / mL de lipídios totais). Calcule o volume de cada componente (enzima, cofator) necessário para atingir a concentração desejada, adicione esses componentes aos proteolipossomas e ajuste o volume para 200 μL com o tampão A (Tabela 2).
- Determinação da osmolalidade interna
- Preparar uma solução de 50 μl como descrito no passo 3.1.1.1, mas sem proteolipossomas, e medir a osmolalidade com um osmómetro de ponto de congelação.
- Prepare uma curva de calibração usando tampão (50 mM KPi pH 7,0) e concentrações variadas de sal (por exemplo, NaCl ou NaCl) ou açúcar. Determine a concentração de osmólito que corresponde à osmolalidade interna (tampão N).
NOTA: Componentes permeáveis à membrana (por exemplo, glicerol) não podem ser usados para corresponder à osmolalidade interna. Para proteínas solubilizadas em tampão contendo glicerol (por exemplo, tampão E), o mesmo tampão deve ser usado sem glicerol. O osmólito escolhido para a preparação de um tampão externo iso-osmótico deve ser impermeável à membrana e não interferir na rede metabólica.
- Congelamento-descongelamento
- Congelar rapidamente (em azoto líquido) os proteolipossomas juntamente com os componentes solúveis e descongelar num banho de água gelada a cerca de 10 °C.
- Repita a etapa 3.1.3.1 para um total de 5x.
PONTO DE PARADA: O procedimento pode ser interrompido aqui. Pule a última etapa de descongelamento e armazene a amostra congelada em nitrogênio líquido por 1-3 dias. Tome cuidado para perfurar as tampas do tubo 2x com uma agulha para evitar a explosão do tubo após a fervura rápida do nitrogênio líquido. O armazenamento em nitrogênio líquido é preferível a -80 °C para minimizar a oxidação lipídica.
- Mistura de componentes
- Dia 2
- Extrusão
NOTA: Todas as etapas de extrusão são realizadas à temperatura ambiente, caso contrário, as seringas estanques ao gás vazarão.- Prepare uma extrusora aplicando um filtro de sua escolha (por exemplo, policarbonato, diâmetro de poro de 400 nm). Lave a extrusora com uma solução contendo o mesmo tampão e metabólitos usados para o encapsulamento das vesículas (por exemplo, tampão O mais 0.1 mM de piranina).
NOTA: Use uma extrusora dedicada para o carregamento de proteolipossomas com piranina, pois o corante adere à superfície da extrusora e pode causar contaminação em amostras posteriores. - Carregue a mistura de encapsulamento na extrusora e passe-a pelo filtro 13x. Colete a solução extrudada em um tubo de 1,5 mL.
- Prepare uma extrusora aplicando um filtro de sua escolha (por exemplo, policarbonato, diâmetro de poro de 400 nm). Lave a extrusora com uma solução contendo o mesmo tampão e metabólitos usados para o encapsulamento das vesículas (por exemplo, tampão O mais 0.1 mM de piranina).
- Cromatografia de exclusão de tamanho (opcional)
NOTA: Esta etapa é realizada para remover moléculas externas, como corantes como piranina, por cromatografia de exclusão de tamanho. Se os corantes não estiverem presentes no sistema e outros componentes não estiverem interferindo em baixas concentrações (observe que as vesículas também são lavadas por ultracentrifugação), então etapa 3.2.2. pode ser ignorado.- Reidrate a resina Sephadex G-75 e despeje-a em uma coluna de vidro (22 cm de comprimento, 1,5 cm de largura). Equilibre a resina com um excesso de tampão externo (por exemplo, tampão N).
- Carregar os proteolipossomas extrudidos do passo 3.2.1.2 na coluna de cromatografia de exclusão de tamanho pré-equilibrada e aplicar um fluxo gravitacional de tampão externo. Descarte o volume de urina (aproximadamente 7 mL); em seguida, colete dez alíquotas de 1 mL. Visualize as alíquotas contendo proteolipossomas por exposição curta a uma lâmpada UV. Agrupe as frações que contêm a maioria dos proteolipossomas (2-4 mL).
- Lavagem e ressuspensão
- Lavar os proteolipossomas extrudidos por ultracentrifugação. Encha um tubo de ultracentrifugação de 6,5 mL com 5,8 mL de tampão N e aplique a amostra extrudada por cima. Se a cromatografia de exclusão de tamanho foi realizada, encha o tubo com as amostras de eluição agrupadas (2-4 mL) e adicione o tampão N a um volume final de 6 mL.
- Centrífuga a 337.000 × g, 30 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e secar bem o tubo de ultracentrifugação com um lenço de papel sem pó, prestando atenção para não tocar no sedimento. Ressuspenda o pellet em um pequeno volume de tampão N (200 μL). Quando o pellet estiver totalmente ressuspenso, encha o tubo até 6 mL com tampão N.
NOTA: a ressuspensão do pellet levará tempo e deve ser feita com cuidado. - Repetir as etapas 3.2.3.1-3.2.3.2 2x, para um total de três lavagens, a menos que seja realizada cromatografia de exclusão de tamanho (caso em que uma etapa de centrifugação é suficiente). Por fim, ressuspenda o pellet para uma concentração desejada (por exemplo, 5,55 mg / mL de lipídio total) adicionando um volume apropriado de tampão N.
PONTO DE PARADA: Os proteolipossomas podem ser usados imediatamente ou armazenados a 4 oC por pelo menos 48 h. O tamanho dos tubos de ultracentrifugação deve ser escolhido com base no tamanho da amostra. Para um pellet de 6,66 mg de lipídios totais, um tubo de 6,5 mL é apropriado. A lavagem de 200 μL de proteolipossomas (33,33 mg de lipídios/mL no total; volume seco de pellets ~ 40 μL)28 para 3 x 6 mL de tampão dilui os componentes externos por um fator de 100 para cada etapa de lavagem. Se forem usados tubos de tamanhos diferentes, é desejável ajustar o número de lavagens de acordo.
- Extrusão
- Dia 3
- Detecção de síntese de ATP por fluorescência
- Misturar os componentes da reacção até um volume final de 120 μL (Quadro 3) numa cubeta de quartzo preto com uma janela de 3 x 5 mm e um volume interno mínimo de 100 μL.
NOTA: Ionóforos podem ser adicionados para dissipar gradientes de íons eletroquímicos. Uma mistura de valinomicina e nigericina (1 μM cada) dissipa efetivamente quaisquer gradientes de prótons e potássio. - Pré-aqueça a amostra em um fluorômetro ajustado para 30 ° C e adquira espectros de excitação de PercevalHR (excitação 400-520 nm, largura de banda 5 nm; emissão 550 nm, largura de banda 5 nm). Uma vez que o sinal da sonda é constante, inicie a rede metabólica pela adição de um excesso de L-arginina (5-10 mM) e glicerol (400 μM) quando a reciclagem de ATP é acoplada à síntese de glicerol 3-fosfato. Acompanhe a reação ao longo do tempo.
- Misturar os componentes da reacção até um volume final de 120 μL (Quadro 3) numa cubeta de quartzo preto com uma janela de 3 x 5 mm e um volume interno mínimo de 100 μL.
- Análise de dados
- Plote a razão F500 / F430 em função do tempo, que é um indicador qualitativo da razão ATP / ADP. Para uma avaliação mais quantitativa da formação de ATP, construa uma curva de calibração em proteolipossomas ou use uma abordagem complementar (por exemplo, quantificação de ATP por quimioluminescência28).
- Detecção de síntese de ATP por fluorescência
| Componente | Concentração final |
| Buffer A | 50 mM KPi pH 7,0 |
| TDT | 2 mM |
| Na-ADP | 10 mM |
| MgCl2 | 10 mM |
| L-ornitina | 0,5 mM |
| Sonda fluorescente (PercevalHR ou piranina) | 5,8 μM ou 0,1 mM, respectivamente |
| ArcA (Arginina deiminase) | 1 μM |
| ArcB (ornitina carbamoiltransferase) | 2 μM |
| ArcC1 (carbamato quinase) | 5 μM |
| GlpK (glicerol quinase) | 1,6 μM |
| Proteolipossomas | 33,33 mg/mL de lipídios totais |
Tabela 2: Componentes de encapsulamento. Os componentes são listados em ordem de adição. As proteínas solúveis estão no tampão E; todos os outros componentes (exceto MgCl2, em água deionizada) estão no tampão A.
| Componente | Concentração final |
| Tampão K | 50 mM KPi pH 7,0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0 |
| Proteolipossomas (5,55 mg/mL de lípidos) | 2,7 mg/mL de lipídios |
| Ionóforos (valinomicina, nigericina) | 1 μM cada |
Tabela 3: Condições experimentais. Os componentes são listados em ordem de adição. Os proteolipossomas estão no tampão N, os ionóforos no DMSO ou EtOH.
4. Aumento de escala de uma rede metabólica para vesículas de tamanho micrométrico
- Dia 1
- Preparação de cavacos microfluídicos
NOTA: Este experimento usa um dispositivo microfluídico desenvolvido por Robinson et al.34. Outros projetos de chips microfluídicos estão disponíveis 35,36,37 e podem ser facilmente implementados neste protocolo.- Corte uma ponta de pipeta de 200 μL a um terço da parte inferior e insira a parte inferior da ponta em um dispositivo de captura microfluídica pré-fabricado.
- Ao reservatório de entrada do chip, adicione 400 μL de solução de β-caseína (2 mg/mL; consulte a etapa 1.5), tomando cuidado para evitar a introdução de ar nesta etapa. Coloque um balde de placa de 96 poços e adicione um tecido de laboratório em uma centrífuga de tubo cônico de mesa. Coloque o chip em cima do tecido e centrifugue por 6 min a 900 × g para permitir a passivação do chip microfluídico. Após a etapa de centrifugação, o nível do líquido deve ser igual no reservatório de entrada e na ponta de saída do chip microfluídico; Verifique se há vazamento do chip. Incube a solução de β-caseína no chip microfluídico por pelo menos 30 min.
- Remover a maior parte da solução de passivação sem introduzir ar e adicionar 400 μl de tampão de lavagem (tampão P). Coloque o cavaco no balde de placas de 96 poços e centrifugue a 900 × g por 6 min. Deixe o chip na solução de lavagem até o uso (por no máximo 4h).
- Preparação de cavacos microfluídicos
- Preparação de gel para a fabricação de proteo-GUVs
NOTA: A descrição a seguir foi tirada e adaptada de25,38.- Dissolva 0,5% (p / p) de uma agarose de baixa temperatura gelificante (LGT) em água deionizada aquecendo a solução no micro-ondas; Certifique-se de que a agarose esteja completamente dissolvida e evite ferver a solução. Manter a agarose a 50 °C até nova utilização.
NOTA: A agarose dissolvida pode ser armazenada em temperatura ambiente por várias semanas. Para reutilizar a agarose, basta derreter o gel no micro-ondas. - Pegue dois slides objetivos e desenhe o contorno do espaçador nos slides. Faça as lâminas hidrofílicas por limpeza de plasma, usando plasma com alto teor de oxigênio por 1 min.
- Adicione a agarose LGT no topo da lâmina até que esteja totalmente coberta com agarose (~ 500 μL); Em seguida, incline a lâmina em um ângulo de 90 ° e drene o excesso de agarose em um lenço de papel. Deixar as lâminas durante 30 min a 50 °C.
- Pegue proteolipossomas armazenados em nitrogênio líquido (seção 3) e descongele no gelo. Diluir as vesículas a 5 mg/ml de lípidos utilizando tampão Q.
NOTA: Os proteolipossomas preparados na seção 3 não contêm proteínas solúveis e podem ser preparados com bastante antecedência se armazenados em nitrogênio líquido. Ao trabalhar com proteoGUVs, certifique-se de sempre filtrar as soluções de trabalho para evitar o entupimento do dispositivo microfluídico. - Sonicar os proteolipossomas utilizando um sonicador de sonda portátil com uma sonda de 1 mm. Sonicar por 10 ciclos de 0,5 s ligado e 0,5 s desligado a 70% de amplitude. Mantenha as vesículas, doravante denominadas proteoSUVs, no gelo por 30 s e repita o processo de sonicação 5x.
- Encha uma seringa de 100 μL (em um dispensador LCP portátil) com a suspensão proteo-SUV. Deposite gotículas de 0,5 μL de proteo-SUVs no gel de agarose previamente preparado; Tenha cuidado para não perturbar a camada de agarose e manter distância suficiente para evitar que as gotículas se fundam.
NOTA O uso de um dispensador LCP portátil permite a deposição de gotículas de maneira reprodutível, mas sistemas alternativos de pipetagem também podem ser usados. Manchas com um capilar de vidro são menos adequadas porque perturbam o gel de agarose seco. - Seque as gotículas de SUV em ~ 10 min usando um fluxo de nitrogênio em vez de ar comprimido para reduzir a possibilidade de oxidação dos lipídios.
- Preparar 1 ml de um tampão concentrado O a 1,25x (quadro 4) no tampão A e passar por um filtro de acetato de celulose de 0,2 μm. Pegue 800 μL da solução concentrada 1,25x e adicione as enzimas solúveis e sondas a uma concentração conforme indicado na Tabela 4. Use água deionizada filtrada para fazer o volume final de 1 mL.
- Preparar 100 μL de solução de expansão contendo todos os componentes da Tabela 4, com excepção das proteínas e do glicerol. Meça a osmolalidade da solução de inchaço usando um osmômetro de ponto de congelamento calibrado de 3 pontos.
NOTA: Prepare 100 μL de solução de inchaço sem proteína e glicerol para determinar com precisão a osmolalidade desta solução. O glicerol, que está presente na solução proteica, afeta a osmolalidade, mas, nos GUVs, o glicerol se difunde rapidamente através da membrana e leva apenas a diferenças osmóticas transitórias. - Monte a câmara de inchaço GUV fazendo um sanduíche de dois copos de objetiva contendo o gel e SUVs secos com um espaçador de Teflon de 1,5 ou 3,0 mm de espessura entre eles. Em seguida, adicione a solução de inchaço na câmara através do pequeno orifício na lateral usando uma seringa e uma agulha.
NOTA: O volume da solução de inchaço pode ser ajustado variando os espaçadores de 1.5 a 3.0 mm.
- Dissolva 0,5% (p / p) de uma agarose de baixa temperatura gelificante (LGT) em água deionizada aquecendo a solução no micro-ondas; Certifique-se de que a agarose esteja completamente dissolvida e evite ferver a solução. Manter a agarose a 50 °C até nova utilização.
- Inchaço das vesículas e colheita de GUVs
- Permita o inchaço das vesículas colocando a câmara a 22 °C durante pelo menos 30 min.
NOTA: O inchaço das vesículas pode ser seguido por microscopia de luz (por exemplo, um microscópio de contraste de fase de mesa ou um microscópio de fluorescência de campo amplo) se as proteínas ou lipídios forem marcados com fluorescência. - Colha os GUVs do gel aplicando agitação física suave batendo a câmara em uma superfície sólida (por exemplo, bancada de laboratório); retire um terço do volume e use a bolha de ar resultante para induzir suavemente o movimento do líquido restante, destacando assim os GUVs do gel.
- Enquanto os GUVs estão inchando, prepare o tampão P e combine a osmolalidade com a solução de inchaço ajustando a concentração de glicose. Filtrar o tampão através de um filtro de seringa de 0,2 μm.
NOTA: Em geral, a solução de lavagem e substrato deve ser mantida dentro de ± 5 mosmol/kg. Qualquer solução que passe pelo chip deve ser muito limpa, pois os contaminantes podem entupir os canais. Faça sempre tampões novos ou armazene tampões preparados a -20 °C e filtre antes de usar.
- Permita o inchaço das vesículas colocando a câmara a 22 °C durante pelo menos 30 min.
- Captura dos GUVs para experimentos de microscopia
- Monte o chip microfluídico passivado no estágio de amostra do microscópio. Verifique se há possíveis defeitos (por exemplo, vazamentos, ar preso, canais entupidos).
NOTA: A verificação do chip pode ser feita bem antes de ser usada para que um novo chip possa ser preparado, se necessário. - Conecte o tubo usando uma agulha dobrada à saída do reservatório e conecte a outra extremidade a uma seringa de 1 mL. Monte a seringa em uma bomba e ajuste a vazão para um máximo de 10 μL / min.
- Remova o tampão de lavagem do reservatório (etapa 4.1.1.3) e substitua por meio novo (tampão P). Inicie o fluxo de tampão através do chip por infusão através da seringa a 1-10 μL/min. Lave com pelo menos 80 μL de tampão de lavagem osmoticamente balanceado (tampão P).
- Remova o excesso de tampão de lavagem do reservatório e adicione os (proteo)GUVs ao reservatório. Ajuste a taxa de fluxo para 0,1-1 μL/min para permitir que os GUVs fluam através do chip. Monitore o chip ao longo do tempo até que GUVs suficientes tenham sido presos no chip.
NOTA: Vesículas com quantidades relativamente grandes (>20 mol%) de lipídios carregados, como fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilserina (PS) ou ácido fosfatídico (PA) ou lipídios não formadores de bicamada, como fosfatidiletanolamina (PE), são introduzidos a uma taxa de fluxo mais baixa através do chip para evitar o estouro. As vesículas compostas de fosfatidilcolina pura (PC) tendem a ser mais estáveis. - Remova o excesso de solução de GUV e adicione tampão de lavagem P, usando um fluxo constante de 0,1-1 μL / min, para trocar o meio externo e lavar os GUVs presos por pelo menos 1 h para remover compostos não encapsulados e diminuir a fluorescência de fundo quando um fluoróforo é encapsulado. Monitore a fluorescência de fundo ao longo do tempo; Se a fluorescência de fundo não diminuir, o chip pode ser bloqueado.
- Localize armadilhas com quantidades suficientes de vesículas e salve suas posições. Aplique as configurações no microscópio (por exemplo, intensidade do laser, ganho, comprimento de onda) e inicie um experimento de série temporal.
- Adicione uma solução de substrato osmoticamente balanceada (tampão R) ao reservatório e inicie uma vazão de 0,5 μL / min.
- Monte o chip microfluídico passivado no estágio de amostra do microscópio. Verifique se há possíveis defeitos (por exemplo, vazamentos, ar preso, canais entupidos).
| Componentes do buffer L | ||
| Componente | 1,25 x concentração | Concentração de trabalho |
| Buffer A | 62,5 mM KPi pH 7,0 | 50 mM KPi pH 7,0 |
| Sacarose | 125 mM | 100 mM |
| TDT | 2,5 mM | 2 mM |
| Na-ADP | 12,5 mM | 10 mM |
| MgCl2 | 12,5 mM | 10 mM |
| L-ornitina | 0,625 mM | 0,5 mM |
| Componentes de encapsulamento | ||
| Piranina ou PercevalHR | 1 mM ou 20 μM | |
| ArcA (Arginina deiminase) | 1 μM | |
| ArcB (ornitina carbamoiltransferase) | 2 μM | |
| ArcC1 (carbamato quinase) | 5 μM | |
Tabela 4: Buffer O e componentes de encapsulamento. Os componentes são listados em ordem de adição. Todos os componentes (exceto MgCl2, em água deionizada) estão no Tampão A. Os componentes de encapsulamento são listados em ordem de adição. Todas as proteínas solúveis em água estão no tampão E.
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Representative Results
A reconstituição de proteínas de membrana solubilizadas em lipossomas requer a desestabilização de vesículas pré-formadas. A adição de pequenas quantidades de Triton X-100 resulta inicialmente em um aumento da absorbância a 540 nm (A540) devido a um aumento no espalhamento da luz pelo inchaço das vesículas (Figura 4). O valor máximo de A540 é o ponto em que os lipossomas são saturados com detergente (Rsat), após o qual qualquer adição adicional de Triton X-100 resultará na solubilização parcial das vesículas. No R sol, os lipossomas são completamente solubilizados (Figura 4). Para a reconstituição de proteínas de membrana, normalmente usamos vesículas desestabilizadas a 60% além de Rsat (indicado pela seta).
A proteína de membrana reconstituída ArcD é usada para transportar L-arginina para dentro e L-ornitina para fora das vesículas e é usada em conjunto com as enzimas encapsuladas ArcA, ArcB e ArcC para reciclar ATP de ADP e fosfato inorgânico. GlpT é um antiportador de glicerol 3-fosfato / fosfato que, juntamente com GlpK, é necessário para a síntese (e excreção) de glicerol 3-fosfato a partir de glicerol mais ATP produzido pela quebra da L-arginina. A adição de 5 mM de L-arginina em t = 0 aos proteolipossomas resulta em um aumento acentuado na razão da fluorescência PercevalHR a 500 e 430 nm de excitação39, que reflete a relação ATP/ADP dentro das vesículas (Figura 5). Após a adição de glicerol, o ATP é usado para a síntese de glicerol 3-fosfato, o que resulta em uma redução da relação ATP/ADP28. A quebra da L-arginina também leva a mudanças de pH, que podem ser quantificadas usando piranina ou pHluorin27.
Figura 5: Reciclagem de ATP pela via de degradação da L-arginina. LUVs a 2,7 mg de lipídios / mL são colocados em uma cubeta e a proporção de fluorescência a 500 nm e 430 nm é registrada. Adicionam-se 5 mM de L-arginina a t = 0. A razão F500 / F430 é uma medida da relação ATP / ADP dentro das vesículas. Abreviatura: LUVs = vesículas unilamelares grandes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os LUVs produtores de ATP também podem ser usados para formar GUVs. A reidratação de proteo-LUVs secos em um gel de agarose LGT resulta na formação de vesículas de tamanho micrométrico (Figura 6). A formação de proteo-GUVs dentro das manchas LUV secas depende muito da concentração local de lipídios e do grau de desidratação. Algumas áreas têm grandes manchas de GUVs, enquanto em outros lugares na mesma gotícula, nenhum ou poucos GUVs podem ser formados. A formação de GUVs via inchaço assistido por agarose LGT resulta em uma variedade de tamanhos de GUV, normalmente de alguns micrômetros a mais de 50 μm.
Figura 6: Imagens DIC de proteoGUVs formadas por inchaço assistido por gel. Barra de escala = 25 μm. Abreviaturas: DIC = contraste de interferência diferencial; GUVs = vesículas unilammelares gigantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os GUVs são colhidos e presos em um dispositivo microfluídico baseado em PDMS passivado com β-caseína (Figura 7). O dispositivo é projetado de forma que muitas vesículas possam ser capturadas e analisadas em um único experimento, e o dispositivo é usado para controlar o ambiente externo (taxa de fluxo, composição do buffer, etc.) 34. Mesmo quando o rendimento de proteo-GUVs é baixo, o fluxo constante de GUVs através do chip microfluídico permite que muitas vesículas sejam coletadas. Uma vez que GUVs suficientes são capturados, o sistema é lavado com um tampão osmoticamente balanceado para remover componentes externos, como proteínas solúveis, pequenas moléculas e sondas fluorescentes. O tampão de lavagem é então substituído por uma solução de substrato de igual osmolalidade contendo 50 mM de KPi (pH 7,0), quantidades variáveis de glicose (para ajustar a osmolalidade) e substratos como 10 mM de L-arginina. Um experimento de série temporal é feito em várias armadilhas do chip microfluídico e as imagens são tiradas a cada 90 s (excitação de 405 nm e 488 nm quando PercevalHR é usado). Além disso, uma imagem de campo claro é tirada em cada ponto de tempo. A razão das intensidades de emissão após excitação a 488 e 405 nm é uma medida da razão ADP/ATP nas vesículas.
Figura 7: Aprisionamento de vesículas com o chip microfluídico. (A) Aprisionamento das vesículas, acompanhado pela capacidade de controlar o ambiente externo e a taxa de fluxo. (B) ProteoGUVs presos em um dispositivo microfluídico e excitados com um laser de 405 nm (verde) e laser de 488 (vermelho). A emissão para ambos os canais é medida a >500 nm. A imagem de campo claro permite a visualização das vesículas sem fluorescência. Barra de escala = 25 μm. Abreviatura: GUVs = vesículas unilamelares gigantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentamos um protocolo para a síntese de proteínas (de membrana) contendo vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (proteoLUVs) e a conversão de proteoLUVs em vesículas unilamelares gigantes (proteoGUVs). O protocolo deve ser aplicável para a reconstituição de outras proteínas de membrana 13,19,30,40 e o encapsulamento de redes metabólicas diferentes das vias de degradação da L-arginina e síntese de glicerol 3-fosfato aqui apresentadas.
A reconstituição de proteínas de membrana em lipossomas geralmente produz uma orientação aleatória das proteínas dentro da membrana lipídica. Para ArcD e Glpt, a orientação não importa, porque as proteínas operam bidirecionalmente e os solutos se movem dependendo do sinal do potencial eletroquímico total. Para proteínas que funcionam em uma direção, metade das moléculas não estará disponível para atividade quando sua orientação for 50/50.
A extrusão de vesículas através de um filtro de policarbonato estreita a distribuição de tamanho, e as vesículas se tornam mais homogêneas quanto menor o tamanho dos poros dos filtros. No entanto, vesículas menores têm o preço de ter um volume menor e, portanto, um número muito pequeno de proteínas (enzimas, proteínas de membrana) por vesícula. Para minimizar a fração de LUVs com um ou mais componentes ausentes, a concentração das proteínas pode ser ajustada conforme mostrado na Figura 3A, B, mas com vesículas muito pequenas, os efeitos estocásticos são inevitáveis.
O método de inchaço assistido por gel baseia-se na deposição de vesículas sonicadas (SUVs) em uma superfície seca de agarose. Durante o processo de secagem, forma-se um gradiente de concentração de vesículas e a concentração de lipídios é mais alta na periferia da mancha. Isso se deve a um fenômeno conhecido como efeito da mancha de café 41,42. Como resultado, apenas uma pequena região dentro da mancha contém uma concentração de lipídios adequada para a formação de GUV. Manchas lipídicas circulares desiguais e concentradas resultam em grandes áreas não utilizadas que não estão disponíveis para a fusão de vesículas; portanto, a eficiência da formação de GUV torna-se baixa nesta abordagem. Para aumentar o rendimento de GUVs, deve-se buscar uma deposição lipídica uniforme, que pode ser realizada por spin coating42 ou alavancando o efeito de coloração de café41.
Outras notas sobre o protocolo:
Deve-se tomar cuidado para que várias proteínas de membrana (>10) sejam reconstituídas em média por vesícula para evitar efeitos estocásticos. Assim, evite proporções lipídio-proteína superiores a 400:1 p/p. Uma orientação aleatória é assumida para a maioria das proteínas.
Idealmente, o volume total de proteínas de membrana é o menor possível e, de qualquer forma, não excede 10-20% do volume do lipossomo. A adição de volumes maiores introduzirá mais detergente e a maioria dos lipossomas pré-formados pode lisar, o que pode ter um efeito negativo na eficiência da reconstituição.
O pré-equilíbrio da extrusora com a solução apropriada é importante para evitar a diluição dos componentes durante o encapsulamento. Idealmente, a solução de pré-equilíbrio também deve conter as enzimas solúveis, mas incluir enzimas pode ser muito caro devido ao volume relativamente grande necessário para o pré-equilíbrio da extrusora. Portanto, normalmente omitimos esses componentes e aceitamos uma diluição de 5% das enzimas.
Devem ser adicionados ionóforos às misturas que contêm proteolipossomas, uma vez que as moléculas são altamente hidrofóbicas e podem adsorver-se nas superfícies se não estiverem presentes vesículas. Deve-se tomar cuidado para que o volume de solvente adicionado seja baixo (<1% do volume total da reação). Os controles são feitos para verificar se os solventes não afetam as redes metabólicas nas vesículas. Concentrações de ionóforo de cerca de 1 μM são geralmente seguras para concentrações lipídicas totais de ~ 3 mg / mL.
Deve-se tomar cuidado para secar bem as gotículas. Se as gotículas não estiverem secas o suficiente, a formação de GUV é menos eficiente, pois os lipídios formarão agregados lipídicos e os MLVs podem se formar quando a solução de inchaço é adicionada.
A glicose é usada para combinar a osmolaridade do meio externo com o interno; este último contém sacarose em vez de glicose para aumentar a densidade das vesículas e, assim, facilitar a sedimentação dos GUVs. Além disso, a glicose no ambiente externo aumenta o contraste de fase, tornando a vesícula mais facilmente visível.
Os efeitos estocásticos são muito menos problemáticos com os GUVs; Mas aqui, a relação superfície-volume pode se tornar inaceitavelmente baixa, de modo que o número de proteínas de membrana (por exemplo, transportadores) se torna limitante para a rede metabólica interna. O método descrito neste protocolo não permite um controle preciso sobre o tamanho dos proteoGUVs, mas a maioria se enquadra na faixa de tamanho de 5-50 μm.
Em conclusão, o trabalho aqui apresentado fornece uma visão abrangente da reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento enzimático em vesículas lipídicas de tamanhos variados. Demonstramos a construção de vesículas funcionais para a síntese de ATP e blocos de construção a partir de precursores simples, como aminoácidos e glicerol. A reconstituição de proteínas de membrana em GUVs continua sendo um desafio, mas os protocolos aqui apresentados abrem caminho para novos desenvolvimentos na pesquisa de biologia sintética de baixo para cima.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Aditya Iyer pela clonagem do gene pBAD-PercevalHR e a Gea Schuurman-Wolters por ajudar na produção e purificação de proteínas. A pesquisa foi financiada pelo programa NWO Gravitation "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
| Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
| D(+)-Glucose | Formedium | - | |
| D(+)-Sucrose | Formedium | - | |
| DDM | Glycon | D97002 -C | |
| Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
| Glycerol | BOOM | 51171608 | |
| Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
| Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
| Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
| Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
| Light microscope | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
| Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
| Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
| Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
| Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
| Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
| Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
| Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
| UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
| β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
References
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