Summary
Presentiamo un protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l'incapsulamento di enzimi e altri componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche e micrometriche.
Abstract
Presentiamo un metodo per incorporare nelle vescicole reti proteiche complesse, che coinvolgono proteine di membrana integrali, enzimi e sensori basati sulla fluorescenza, utilizzando componenti purificati. Questo metodo è rilevante per la progettazione e la costruzione di bioreattori e lo studio di complesse reti di reazioni metaboliche fuori equilibrio. Iniziamo ricostituendo (multiple) proteine di membrana in grandi vescicole unilamellari (LUV) secondo un protocollo precedentemente sviluppato. Quindi incapsulamo una miscela di enzimi purificati, metaboliti e sensori basati sulla fluorescenza (proteine fluorescenti o coloranti) tramite liofilizzazione-scongelamento-estrusione e rimuoviamo i componenti non incorporati mediante centrifugazione e/o cromatografia ad esclusione dimensionale. Le prestazioni delle reti metaboliche vengono misurate in tempo reale monitorando il rapporto ATP/ADP, la concentrazione di metaboliti, il pH interno o altri parametri mediante lettura a fluorescenza. Le nostre vescicole contenenti proteine di membrana con diametro di 100-400 nm possono essere convertite in vescicole unilamellari giganti (GUV), utilizzando le procedure esistenti ma ottimizzate. L'approccio consente l'inclusione di componenti solubili (enzimi, metaboliti, sensori) in vescicole di dimensioni micrometriche, aumentando così il volume dei bioreattori di ordini di grandezza. La rete metabolica contenente i GUV è intrappolata in dispositivi microfluidici per l'analisi mediante microscopia ottica.
Introduction
Il campo della biologia sintetica bottom-up si concentra sulla costruzione di cellule (minime) 1,2 e bioreattori metabolici per scopi biotecnologici 3,4 o biomedici 5,6,7,8. La costruzione di cellule sintetiche fornisce una piattaforma unica che consente ai ricercatori di studiare le proteine (di membrana) in condizioni ben definite che imitano quelle degli ambienti nativi, consentendo la scoperta di proprietà emergenti e funzioni biochimiche nascoste delle proteine e delle reti di reazione9. Come passo intermedio verso una cellula sintetica funzionante in modo autonomo, vengono sviluppati moduli che catturano le caratteristiche essenziali delle cellule viventi come la conservazione dell'energia metabolica, la sintesi di proteine e lipidi e l'omeostasi. Tali moduli non solo migliorano la nostra comprensione della vita, ma hanno anche potenziali applicazioni nei campi della medicina8 e della biotecnologia10.
Le proteine transmembrana sono al centro di praticamente qualsiasi rete metabolica in quanto trasportano molecole dentro o fuori dalla cellula, segnalano e rispondono alla qualità dell'ambiente e svolgono numerosi ruoli biosintetici. Pertanto, l'ingegnerizzazione di moduli metabolici in cellule sintetiche richiede nella maggior parte dei casi la ricostituzione di proteine di membrana integrali e/o periferiche in un doppio strato di membrana composto da lipidi specifici e ad alta integrità (bassa permeabilità). La gestione di queste proteine di membrana è impegnativa e richiede conoscenze specifiche e capacità sperimentali.
Sono stati sviluppati diversi metodi per ricostituire le proteine di membrana all'interno delle vescicole fosfolipidiche, il più delle volte con lo scopo di studiare la funzione11,12, la regolazione13, le proprietà cinetiche14,15, la dipendenza dai lipidi15,16 e/o la stabilità17 di una specifica proteina. Questi metodi comportano la rapida diluizione delle proteine solubilizzate con detergente in mezzi acquosi in presenza di lipidi18, la rimozione dei detergenti mediante incubazione di proteine solubilizzate con detergente con vescicole lipidiche destabilizzate con detergente e l'assorbimento del detergente o dei detergenti su perle di polistirene19, o la rimozione dei detergenti mediante dialisi o cromatografia ad esclusione dimensionale20. I solventi organici sono stati utilizzati per formare vescicole lipidiche, ad esempio, attraverso la formazione di interfasi olio-acqua21, ma la maggior parte delle proteine integrali di membrana sono inattivate quando esposte a tali solventi.
Nel nostro laboratorio, ricostituiamo per lo più le proteine di membrana con il metodo dell'assorbimento dei detergenti per formare grandi vescicole unilamellari (LUV)19. Questo metodo consente la co-ricostituzione di più proteine di membrana e l'incapsulamento nel lume della vescicola di enzimi, metaboliti e sonde22,23. I LUV contenenti proteine di membrana possono essere convertiti in vescicole unilamellari giganti (GUV) con/senza incapsulamento di componenti idrosolubili, utilizzando l'elettroformazione24 o il rigonfiamento assistito da gel25 e condizioni specifiche per preservare l'integrità delle proteine di membrana26.
Questo articolo presenta un protocollo per la ricostituzione nei LUV di una rete metabolica fuori equilibrio che rigenera l'ATP attraverso la scomposizione della L-arginina in L-ornitina27. La formazione di ATP è accoppiata alla produzione di glicerolo-3-fosfato (G3P), un importante elemento costitutivo per la sintesi dei fosfolipidi22,28. La via metabolica è costituita da due proteine integrali di membrana, un'arginina/ornitina (ArcD) e un antiporter G3P/Pi (GlpT). Inoltre, sono necessari tre enzimi solubili (ArcA, ArcB, ArcC) per il riciclaggio dell'ATP e il GlpK viene utilizzato per convertire il glicerolo in glicerolo-3-fosfato, utilizzando l'ATP dalla scomposizione della L-arginina, vedere la Figura 1 per una panoramica schematica del percorso. Questo protocollo rappresenta un buon punto di partenza per la futura costruzione di reti di reazione ancora più complesse, per la sintesi di lipidi o proteine o per la divisione delle cellule. La composizione lipidica delle vescicole supporta l'attività di un'ampia varietà di proteine integrali di membrana ed è stata ottimizzata per il trasporto di diverse molecole dentro o fuori le vescicole 27,29,30.
Figura 1: Panoramica della via per la produzione di ATP e la sintesi e l'escrezione del glicerolo-3-fosfato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
In breve, le proteine di membrana purificate (solubilizzate in dodecil-β-D-maltoside, DDM) vengono aggiunte alle vescicole lipidiche preformate che sono state destabilizzate con Triton X-100, che consente l'inserimento delle proteine nella membrana. Le molecole detergenti vengono successivamente (lentamente) rimosse mediante l'aggiunta di perle di polistirene attivate, con conseguente formazione di proteoliposomi ben sigillati. I componenti solubili possono quindi essere aggiunti alle vescicole e incapsulati tramite cicli di congelamento-scongelamento, che intrappolano le molecole nel processo di fusione della membrana. Le vescicole ottenute sono altamente eterogenee e molte sono multilamellari. Vengono quindi estrusi attraverso un filtro in policarbonato con una dimensione dei pori di 400, 200 o 100 nm, che produce vescicole di dimensioni più uniformi; Più piccola è la dimensione dei pori, più omogenee e unilamellari sono le vescicole ma al prezzo di un volume interno inferiore. Le proteine non incorporate e le piccole molecole vengono rimosse dalla soluzione esterna mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. I proteoLUV possono essere convertiti in vescicole di dimensioni micrometriche mediante rigonfiamento assistito da gel, e questi proteoGUV vengono quindi raccolti e intrappolati in un chip microfluidico per la caratterizzazione e la manipolazione microscopica. La Figura 2 mostra una panoramica schematica dell'intero protocollo.
Figura 2: Panoramica del protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l'incapsulamento degli enzimi e dei componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche (LUV) e micrometriche (GUV). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I protocolli di ricostituzione e incapsulamento funzionano bene e la funzionalità delle proteine viene mantenuta, ma i proteoLUV e i proteoGUV sono di dimensioni eterogenee. Gli approcci microfluidici31,32 consentono la formazione di vescicole di dimensioni micrometriche di dimensioni più omogenee, ma la ricostituzione funzionale delle proteine di membrana non è generalmente possibile perché il solvente residuo nel doppio strato inattiva le proteine. Le dimensioni dei proteoLUV variano da 100 a 400 nm e, a basse concentrazioni di enzimi, l'incapsulamento può portare a vescicole con vie metaboliche incomplete (effetti stocastici; vedi Figura 3). I LUV sono ideali per la costruzione di specifici moduli metabolici, come mostrato qui per la produzione di ATP e di elementi costitutivi come il G3P. Tali proteoLUV possono potenzialmente essere incapsulati in GUV e fungere da compartimenti simili a organelli per le vescicole dell'ospite.
Figura 3: Numero di molecole per vescicola con un diametro di 100, 200 o 400 nm. (A) Quando le proteine incapsulate (enzimi, sonde) sono nell'intervallo 1-10 μM. (B) La ricostituzione viene eseguita a 1-1.000, da 1 a 10.000 e da 1 a 100.000 proteine di membrana per lipide (mol/mol). Partiamo dal presupposto che le molecole siano incapsulate alle concentrazioni indicate e incorporate nella membrana a questi rapporti proteina-lipide. Per alcuni enzimi, abbiamo visto che si legano alle membrane, che possono aumentare la loro concentrazione apparente nelle vescicole. Abbreviazione: LPR = Rapporto lipidico-proteico Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. Preparazione generale
- Prodotti chimici
- Sciogliere i lipidi (in polvere) a 25 mg/mL in CHCl3 per produrre liposomi preformati.
NOTA: È preferibile preparare brodi lipidici freschi, ma le soluzioni madre possono essere conservate anche a -20 °C per alcune settimane. Lavorare con i lipidi in polvere è più accurato rispetto all'utilizzo di lipidi già solubilizzati in CHCl3. CHCl3 deve essere maneggiato utilizzando pipette e/o siringhe di vetro e conservato in contenitori di vetro poiché CHCl3 dissolve la plastica. - Sciogliere piccole molecole (nucleotidi, amminoacidi, sonde di fluorescenza) per la procedura di incapsulamento in 50 mM KPi (Tampone A, vedere Tabella 1) e regolare il pH a 7,00 ± 0,01. Sciogliere MgCl2 in acqua deionizzata per evitare la formazione di precipitati di fosfato di magnesio.
NOTA: Le soluzioni madre possono essere conservate a -20 °C per alcune settimane, ad eccezione del DTT, che viene preparato fresco il giorno dell'esperimento. - Sciogliere gli ionofori (ad es. valinomicina, nigericina) in DMSO o EtOH ad una concentrazione madre di 100-500 μM. Conservare a -20 °C per alcune settimane; evitare l'evaporazione.
NOTA: Il DMSO non è volatile e quindi è preferito all'EtOH. Utilizzare fiale di vetro invece di plastica per evitare l'adesione degli ionofori alla superficie delle fiale.
- Sciogliere i lipidi (in polvere) a 25 mg/mL in CHCl3 per produrre liposomi preformati.
- Buffer
- Preparare tamponi freschi il giorno dell'esperimento (Tabella 1). Non conservare per più di 24 ore.
- Purificazione delle proteine solubili
- Esprimere ArcA, ArcB, ArcC (usiamo una variante specifica denominata ArcC1), PercevalHR e GlpK come descritto in precedenza 27,28,33. Assicurati di aggiungere il 10% di glicerolo v/v al tampone di lisi cellulare, che migliora la stabilità delle proteine. Purificare le proteine solubili come descritto 27,28,33 e di seguito riportato.
- Scongelare 10 ml di lisato cellulare (~5 g di peso umido) in un bagno di acqua ghiacciata. Nel frattempo, applicare 2 mL (1 CV) di resina Ni2+-Sepharose su una colonna a flusso per gravità (capacità 20 mL) con acqua deionizzata (12 CV) e tampone B (4 CV) per il lavaggio. Trasferire il lisato scongelato nel ghiaccio; lavorare sul ghiaccio, se non diversamente specificato.
- Aggiungere l'imidazolo a una concentrazione finale di 10 mM al lisato scongelato, quindi versare la soluzione sulla colonna di flusso per gravità. Incubare per 1 ora a 4 °C con nutazione delicata.
- Dopo 1 ora, scartare il flusso e lavare la resina con il Buffer C (20 CV).
- Eluire la proteina con il tampone D. Utilizzare il 60% CV per la prima fase di eluizione, seguita da 4-6 fasi del 40% CV.
- Determinare la concentrazione proteica e aggiungere Na-EDTA a una concentrazione finale di 5 mM.
- Centrifugare le proteine purificate in una centrifuga da tavolo refrigerata (velocità massima, 10 minuti, 4 °C). Purificare mediante cromatografia ad esclusione dimensionale utilizzando il tampone E. Raggruppare le frazioni di eluizione e concentrarle a ~10 mg/mL con un filtro concentrante con un cut-off di 30 kDa. Preparare aliquote di dimensioni adeguate (~ 20 μL), congelare con azoto liquido e conservare a -80 °C per un uso successivo.
NOTA: È importante concentrare gli enzimi a 50-100 μM per ridurre al minimo il volume necessario per l'incapsulamento.
- Purificazione delle proteine di membrana
- Overexpress ArcD e GlpT come descritto in precedenza 22,27,33. Assicurarsi di aggiungere il 10% v/v di glicerolo al tampone di lisi cellulare; per la purificazione dell'ArcD, includere 2 mM di agente riducente (ad es. DTT) nel tampone. Purificare le proteine marcate per affinità mediante cromatografia Ni2+-Sefarosio.
- Scongelare un'aliquota di vescicole di membrana grezze (10-20 mg di proteina di membrana totale) in un bagno di acqua ghiacciata.
NOTA: Una volta scongelato, lavorare sempre sul ghiaccio se non diversamente specificato. Vedere la Tabella 1 per i buffer utilizzati in questa sezione. - Aggiungere le vescicole di membrana al tampone F (ArcD) o al tampone G (GlpT) fino a un volume finale di 6 mL. Incubare il campione per 1 ora a 4 °C con una leggera nutazione.
- Separare le proteine solubilizzate della membrana dai detriti della membrana mediante ultracentrifugazione (337.000 × g, 30 min, 4 °C). Nel frattempo, applicare 0,25 mL (1 CV) di resina di Ni2+-Sepharose su una colonna di flusso per gravità (capacità di 10 mL) con acqua deionizzata (40 CV) e 20 CV di Buffer H (ArcD) o Buffer I (GlpT).
- Versare la proteina solubilizzata sulla colonna di flusso per gravità e aggiungere l'imidazolo a una concentrazione finale di 10 mM. Incubare per 1 ora a 4 °C con una leggera nutazione.
- Dopo 1 ora, scartare il flusso e lavare la resina con 20 CV di Buffer J (ArcD) o Buffer K (GlpT).
- Eluire la proteina di membrana nei passaggi 60% CV (1st) e 40% CV (2nd-6 th) con Buffer L (ArcD) o Buffer M (GlpT).
- Determinare la concentrazione proteica e continuare con il paragrafo 2.2. per la ricostituzione della membrana.
NOTA: La purificazione per esclusione dimensionale non viene necessariamente eseguita per le proteine di membrana poiché la ricostituzione di membrana produce una purificazione simile. I passaggi 1.4 e 2.2 possono essere eseguiti in 1 giorno di lavoro. Iniziare con la purificazione delle proteine (passaggio 1.4) al mattino e continuare con la ricostituzione (passaggio 2.2) nel pomeriggio. La ricostituzione termina il giorno successivo (vedere paragrafo 2.2 per i dettagli). PUNTO DI ARRESTO: ArcD e GlpT purificati e solubilizzati in DDM possono essere conservati a -80 oC per un uso successivo, ma questo non è vero per tutte le proteine di membrana. Preparare aliquote di dimensioni adeguate (50-200 μl), congelare con azoto liquido e conservare a -80 °C per un uso successivo. Queste proteine sono attive per diversi mesi se conservate a -80 °C in presenza del 10% v/v di glicerolo.
- Scongelare un'aliquota di vescicole di membrana grezze (10-20 mg di proteina di membrana totale) in un bagno di acqua ghiacciata.
- Overexpress ArcD e GlpT come descritto in precedenza 22,27,33. Assicurarsi di aggiungere il 10% v/v di glicerolo al tampone di lisi cellulare; per la purificazione dell'ArcD, includere 2 mM di agente riducente (ad es. DTT) nel tampone. Purificare le proteine marcate per affinità mediante cromatografia Ni2+-Sefarosio.
- Preparazione della β-caseina per passivazione
- Risospendere 100 mg di β-caseina in 20 mL di acqua deionizzata e titolare con 1 M di NaOH fino a quando la β-caseina non è completamente disciolta. Quindi, aggiungere 1 M di acido acetico per regolare il pH a 7,0 e riempire il volume a 50 ml con acqua deionizzata. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm e formare aliquote da 500 μl.
NOTA La β-caseina può essere conservata a -20 °C per 6 mesi. Si consiglia di filtrare nuovamente la β-caseina prima dell'uso per evitare che gli aggregati di β-caseina ostruiscano il chip microfluidico.
- Risospendere 100 mg di β-caseina in 20 mL di acqua deionizzata e titolare con 1 M di NaOH fino a quando la β-caseina non è completamente disciolta. Quindi, aggiungere 1 M di acido acetico per regolare il pH a 7,0 e riempire il volume a 50 ml con acqua deionizzata. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm e formare aliquote da 500 μl.
| Buffer | Composizione | ||
| Buffer A | 50 mM KPi pH 7,0 | ||
| Buffer B | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerolo, 10 mM imidazolo, pH 7,5 | ||
| Buffer C | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerolo, 50 mM imidazolo, pH 7,5 | ||
| Buffer D | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerolo, 500 mM imidazolo, pH 7,5 | ||
| Buffer E | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glicerolo, pH 7,0 | ||
| Buffer F | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5% p/v DDM, 10% v/v glicerolo, 2 mM β-mercaptoetanolo, pH 7,5 | ||
| Buffer G | 50 mM Tris-HCl, 0,5% p/v DDM, 20% v/v glicerolo, pH 8 | ||
| Buffer H | 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02% p/v DDM, 10% v/v glicerolo, 2 mM β-mercaptoetanolo, 10 mM imidazolo, pH 7,5 | ||
| Buffer I | 50 mM Tris-HCl, 0,04% p/v DDM, 20% v/v glicerolo, 10 mM imidazolo, pH 8,0 | ||
| Buffer J | 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% p/v DDM, 10% v/v glicerolo, 2 mM β-mercaptoetanolo, 50 mM imidazolo, pH 7,5 | ||
| Buffer K | 50 mM Tris-HCl, 0,04% p/v DDM, 20% v/v glicerolo, 50 mM imidazolo, pH 8 | ||
| Buffer L | 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% p/v DDM, 10% v/v glicerolo, 2 mM β-mercaptoetanolo, 500 mM imidazolo, pH 7,5 | ||
| Buffer M | 50 mM Tris-HCl, 0,04% p/v DDM, 20% v/v glicerolo, 500 mM imidazolo, pH 8 | ||
| Buffer N | 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0 | ||
| Buffer O | 50 mM KPi, 0,5 mM L-ornitina, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7,0 | ||
| Tampone P | 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM glucosio (x viene variato per adattarsi all'osmolarità del mezzo esterno e interno) | ||
| Tampone Q | 50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM saccarosio, 2 mM DTT | ||
| Buffer R | 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginina, x mM glucosio | ||
Tabella 1: Buffer utilizzati in questo protocollo.
2. Proteoliposomi: ricostituzione di proteine di membrana purificate in vescicole lipidiche preformate
- Giorno 1
- Preparazione di vescicole lipidiche preformate
- Scegliere la composizione lipidica (ad esempio, fosfolipidi sintetici, lipidi polari di E. coli ) sulla base dei requisiti delle proteine di membrana.
NOTA: Una miscela di DOPE, DOP e DOPC (25:25:50 mol%) è un buon punto di partenza, ma per alcune proteine potrebbero essere necessari steroli o cardiolipina; Per le proteine della membrana plasmatica del lievito, includiamo i lipidi palmitoil-oleyl invece del dieoleoyl30. Una miscela di droga, DOG e DOPC (25:25:50 mol%) è sufficiente per la ricostituzione di ArcD e GlpT. - Mescolare i lipidi desiderati (solubilizzati in CHCl3) ed evaporare il CHCl3 in un evaporatore rotante fino a formare un film lipidico. Lavare i lipidi aggiungendo etere etilico in volume uguale al CHCl3. Far evaporare l'etere etilico e ottenere un film lipidico secco.
- Risospendere il film lipidico a 20 mg/mL di lipidi totali in mezzi acquosi (tampone A). Iniziare con metà del volume totale e agitare delicatamente; Quindi, trasferire con cura i lipidi in un tubo pulito o in un flacone di dimensioni adeguate. Aggiungere il nuovo tampone A al pallone e ripetere la procedura per sciogliere i lipidi rimanenti e trasferirli in un nuovo recipiente. Aggiungere ulteriore tampone A per raggiungere una concentrazione finale di 20 mg/mL.
- Sonicare i lipidi risospesi utilizzando un sonicatore a sonda. Utilizzare i seguenti parametri per una punta del sonicatore con un diametro di 6 mm: intensità 4 μm, ampiezza 70%, 5 s on, 45 s off, 16 cicli. Immergere i lipidi in un bagno di acqua ghiacciata contenente EtOH per evitare il surriscaldamento dovuto alla sonicazione.
- Congelare il campione sonicato (volume di 40 mL in una provetta da centrifuga da 50 mL) in azoto liquido e scongelare il campione in un bagno d'acqua a temperatura ambiente. Ripeti una volta; quindi, aliquotare i liposomi nei volumi desiderati (ad esempio, 1 ml o 20 mg di lipidi totali in una provetta di plastica da 1,5 ml).
PUNTO DI ARRESTO: A questo punto è possibile interrompere la procedura. Congelare nuovamente ogni aliquota (terzo ciclo) e conservarla in azoto liquido per un massimo di alcuni mesi. Fare attenzione a forare due volte i coperchi delle provette con un ago per evitare l'esplosione della provetta durante l'ebollizione rapida dell'azoto liquido.
- Scegliere la composizione lipidica (ad esempio, fosfolipidi sintetici, lipidi polari di E. coli ) sulla base dei requisiti delle proteine di membrana.
- Preparazione di vescicole lipidiche preformate
- Giorno 2
- Ricostituzione di proteine di membrana purificate in liposomi preformati
- Scongelare un'aliquota di liposomi (20 mg di lipidi totali) a bagnomaria a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare un estrusore applicando un filtro a scelta (es. policarbonato, diametro dei pori di 400 nm); pre-equilibrare l'estrusore con il Buffer A; e caricare i liposomi scongelati ("soluzione lattiginosa") nell'estrusore e passarli 13 volte attraverso il filtro. Raccogliere i liposomi estrusi (ora grandi vescicole unilamellari; "soluzione opaca") in recipiente di vetro o plastica di dimensioni adeguate (ad es. 15 mL). Diluire i liposomi a 4 mg/mL con il tampone A integrato con 2 mM di DTT.
- Trasferire 1 mL di liposomi da 4 mg/mL in una cuvetta trasparente da 1 mL. In uno spettrofotometro, misurare la densità ottica iniziale a 540 nm. Versare nuovamente il campione misurato e aggiungere 50 μl di Triton X-100 al 10% v/v ai liposomi.
NOTA: Un volume di titolazione di 50 μL di Triton-X100 al 10% è adatto per 20 mg di lipidi in un volume di 5 mL; l'aggiunta di Triton X-100 diluirà i lipidi del ~5%. Regolare il volume di titolazione quando si lavora con diverse quantità di liposomi. Per ottenere segnali di densità ottica stabili, titolare i liposomi con Triton X-100 a temperatura ambiente. - Ripetere il passaggio 2.2.1.2 e annotare quando viene raggiunta una densità ottica massima (Rsat). Procedere ulteriormente con la titolazione fino a raggiungere una densità ottica di circa il 60% di Rsat (Figura 4). Versare nuovamente le vescicole destabilizzate con detergente nella provetta di vetro/plastica (il volume finale è ora di circa 5,2 ml), trasferire il campione nel ghiaccio e lasciarlo raffreddare.
- Aggiungere le proteine di membrana purificate ai liposomi destabilizzati per raggiungere il rapporto lipidi/proteine (p/p) desiderato. Utilizzare un rapporto da 400:1 a 100:1 p/p; poiché sia ArcD che GlpT hanno pesi molecolari di ~55 kDa, un rapporto lipidi/proteine di 400:1 p/p corrisponde a ~30.000 lipidi per proteina e ~ 50 molecole di ArcD e GlpT ciascuna per vescicole con un diametro di 400 nm.
NOTA: Qui usiamo 400:1 p/p, corrispondente a 50 μg di ciascuna proteina per 20 mg di lipidi. - Nutare i campioni a 4 °C per 15 minuti per consentire alle proteine di membrana di inserirsi nella membrana liposomiale destabilizzata.
- Per rimuovere il detersivo, aggiungere 200 mg di perle di polistirene secco, preparate secondo le istruzioni del produttore. Nutare a 4 °C per altri 15 min.
NOTA: Una quantità di 200 mg di perle secche è adatta per 20 mg di lipidi, ma deve essere regolata quando si utilizza una dimensione del campione diversa. - Ripetere il passaggio 2.2.1.6 2x, per un totale di tre aggiunte di perline di polistirolo. Quindi, incubare per una notte a 4 °C con nutazione delicata.
- Ricostituzione di proteine di membrana purificate in liposomi preformati
- Giorno 3
- Ripetere il passaggio 2.2.1.6; tuttavia, questa volta, nutare a 4 °C per 1 ora.
- Fissare una colonna di flusso per gravità vuota (capacità di 10 mL) sopra una provetta per ultracentrifugazione vuota da 6,5 mL su ghiaccio. Versare il campione nella colonna e raccogliere i proteoliposomi nella provetta per ultracentrifugazione (le perle vengono trattenute nella colonna).
- Lavare le perle con 0,5 mL di tampone A integrato con 2 mM DTT e raccogliere il filtrato nella provetta di ultracentrifugazione.
- Concentrare i proteoliposomi mediante ultracentrifugazione (337.000 × g, 30 min, 4 oC). Risospendere i proteoliposomi in un volume totale di 200 μL (100 mg di lipidi/mL) nel tampone A integrato con 2 mM DTT; il volume secco delle vescicole dopo la centrifugazione è compreso tra ~40 e 120 μL27. Suddividere in aliquote della dimensione desiderata (ad esempio, tre aliquote da 6,66 mg di lipidi totali).
NOTA: La dimensione dell'aliquota è arbitraria, ma influenzerà la dimensione del pellet nei passaggi successivi (vedere il passaggio 3.2.3.1). PUNTO DI ARRESTO: La procedura può essere interrotta qui. Congelare ogni aliquota e conservarla in azoto liquido per un massimo di alcune settimane. Fare attenzione a forare due volte i coperchi delle provette con un ago per evitare l'esplosione della provetta dopo l'ebollizione rapida dell'azoto liquido.
Figura 4: Titolazione di liposomi preformati con Triton X-100. I liposomi a 5 mg di lipidi/mL vengono estrusi attraverso un filtro in policarbonato (400 nm) in 50 mM KPi (pH 7,0) e quindi titolati con Triton X-100 (fase del protocollo 2.2.1.2). La torbidità delle vescicole è misurata ad A540. La freccia indica la concentrazione di Triton X-100 alla quale le vescicole sono sufficientemente destabilizzate per l'inserimento spontaneo delle proteine di membrana come descritto in19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Incapsulamento di una rete metabolica per il riciclo dell'ATP e la sintesi del glicerolo 3-P in vescicole di dimensioni submicroniche
- Giorno 1
- Miscelazione dei componenti
- Per un incapsulamento standard, utilizzare 66,6 μL di proteoliposomi in un volume finale di 200 μL (33,33 mg/mL di lipidi totali). Calcolare il volume di ciascun componente (enzima, cofattore) necessario per raggiungere la concentrazione desiderata, aggiungere questi componenti ai proteoliposomi e regolare il volume a 200 μL con il tampone A (Tabella 2).
NOTA: La concentrazione proteica può essere regolata in base alla configurazione sperimentale. Tuttavia, si deve fare attenzione che siano presenti in media diverse copie (>10) di ciascun enzima per vescicola, per evitare effetti stocastici indesiderati. Concentrazioni > 1 μM sono generalmente sicure; 1 μM in una vescicola con un diametro di 400 nm corrisponde a circa 20 copie (Figura 3). - Pipettare il tampone A in una provetta vuota da 1,5 mL e aggiungere DTT, Na-ADP, MgCl2, L-ornitina (e piranina, se necessario per le misure di pH interno). Quindi, aggiungi gli enzimi e mescola delicatamente. Aggiungere la soluzione sopra i proteoliposomi preformati e agitare brevemente a bassa velocità.
NOTA: È importante aggiungere Na-ADP prima di MgCl2 per evitare la formazione indesiderata di precipitati di fosfato di magnesio. Il vortice è necessario per una corretta miscelazione della soluzione viscosa; Tuttavia, ridurre al minimo la durata e la velocità per evitare danni meccanici alle proteine. PercevalHR e la piranina non possono essere co-incapsulati perché i loro spettri si sovrappongono.
- Per un incapsulamento standard, utilizzare 66,6 μL di proteoliposomi in un volume finale di 200 μL (33,33 mg/mL di lipidi totali). Calcolare il volume di ciascun componente (enzima, cofattore) necessario per raggiungere la concentrazione desiderata, aggiungere questi componenti ai proteoliposomi e regolare il volume a 200 μL con il tampone A (Tabella 2).
- Determinazione dell'osmolalità interna
- Preparare una soluzione da 50 μl come descritto al punto 3.1.1.1 ma senza proteoliposomi, e misurare l'osmolalità con un osmometro con punto di congelamento.
- Preparare una curva di calibrazione utilizzando un tampone (50 mM KPi pH 7,0) e concentrazioni variabili di sale (ad es. NaCl o NaCl) o zucchero. Determinare la concentrazione di osmolito che corrisponde all'osmolalità interna (tampone N).
NOTA: I componenti permeabili alla membrana (ad es. glicerolo) non possono essere utilizzati per abbinare l'osmolalità interna. Per le proteine solubilizzate in tampone contenente glicerolo (ad esempio, il tampone E), lo stesso tampone deve essere utilizzato senza glicerolo. L'osmolita scelto per la preparazione di un tampone esterno iso-osmotico deve essere impermeabile alla membrana e non interferire con la rete metabolica.
- Congelamento-scongelamento
- Congelare rapidamente (in azoto liquido) i proteoliposomi insieme ai componenti solubili e scongelarli in un bagno di ghiaccio d'acqua a circa 10 °C.
- Ripetere il passaggio 3.1.3.1 per un totale di 5 volte.
PUNTO DI ARRESTO: La procedura può essere interrotta qui. Saltare l'ultima fase di scongelamento e conservare il campione congelato in azoto liquido per 1-3 giorni. Fare attenzione a forare i coperchi delle provette 2 volte con un ago per evitare l'esplosione della provetta dopo l'ebollizione rapida dell'azoto liquido. Lo stoccaggio in azoto liquido è preferibile a temperature superiori a -80 °C per ridurre al minimo l'ossidazione dei lipidi.
- Miscelazione dei componenti
- Giorno 2
- Estrusione
NOTA: Tutte le fasi di estrusione vengono eseguite a temperatura ambiente, altrimenti le siringhe a tenuta di gas perderanno.- Preparare un estrusore applicando un filtro a scelta (ad es. policarbonato, diametro dei pori di 400 nm). Lavare l'estrusore con una soluzione contenente lo stesso tampone e metaboliti utilizzati per l'incapsulamento delle vescicole (ad esempio, tampone O più 0,1 mM di piranina).
NOTA: Utilizzare un estrusore dedicato per il caricamento di proteoliposomi con piranina poiché il colorante si attacca alla superficie dell'estrusore e può causare contaminazione nei campioni successivi. - Caricare la miscela di incapsulamento nell'estrusore e passarla attraverso il filtro 13x. Raccogliere la soluzione estrusa in una provetta da 1,5 mL.
- Preparare un estrusore applicando un filtro a scelta (ad es. policarbonato, diametro dei pori di 400 nm). Lavare l'estrusore con una soluzione contenente lo stesso tampone e metaboliti utilizzati per l'incapsulamento delle vescicole (ad esempio, tampone O più 0,1 mM di piranina).
- Cromatografia ad esclusione dimensionale (opzionale)
NOTA: Questo passaggio viene eseguito per rimuovere molecole esterne come coloranti come la piranina mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. Se i coloranti non sono presenti nel sistema e altri componenti non interferiscono a basse concentrazioni (si noti che le vescicole vengono successivamente lavate anche mediante ultracentrifugazione), passare 3.2.2. può essere saltato.- Reidratare la resina Sephadex G-75 e versarla in una colonna di vetro (22 cm di lunghezza, 1,5 cm di larghezza). Equilibrare la resina con un eccesso di tampone esterno (ad es. Buffer N).
- Caricare i proteoliposomi estrusi dal passaggio 3.2.1.2 sulla colonna cromatografica preequilibrata ad esclusione dimensionale e applicare un flusso gravitazionale di tampone esterno. Eliminare il volume del vuoto (circa 7 mL); quindi, raccogliere dieci aliquote da 1 ml. Visualizzare le aliquote contenenti proteoliposomi mediante una breve esposizione a una lampada UV. Raggruppare le frazioni contenenti la maggior parte dei proteoliposomi (2-4 mL).
- Lavaggio e risospensione
- Lavare i proteoliposomi estrusi mediante ultracentrifugazione. Riempire una provetta per ultracentrifugazione da 6,5 mL con 5,8 mL di Buffer N e applicare il campione estruso sulla parte superiore. Se è stata eseguita una cromatografia ad esclusione dimensionale, riempire la provetta con i campioni di eluizione aggregati (2-4 mL) e aggiungere il tampone N a un volume finale di 6 mL.
- Centrifugare a 337.000 × g, 30 min, 4 °C. Eliminare il surnatante e asciugare accuratamente la provetta per ultracentrifugazione con un panno privo di polvere, facendo attenzione a non toccare il pellet. Risospendere il pellet in un piccolo volume di tampone N (200 μl). Quando il pellet è completamente risospeso, riempire la provetta fino a 6 mL con il Buffer N.
NOTA: la risospensione del pellet richiederà tempo e deve essere eseguita con attenzione. - Ripetere i passaggi 3.2.3.1-3.2.3.2 2 volte, per un totale di tre lavaggi, a meno che non si esegua una cromatografia ad esclusione dimensionale (nel qual caso è sufficiente una fase di centrifugazione). Infine, risospendere il pellet a una concentrazione desiderata (ad esempio, 5,55 mg/mL di lipidi totali) aggiungendo un volume appropriato di tampone N.
PUNTO DI ARRESTO: I proteoliposomi possono essere utilizzati immediatamente o conservati a 4 oC per almeno 48 ore. La dimensione delle provette per ultracentrifugazione deve essere scelta in base alla dimensione del campione. Per un pellet di 6,66 mg di lipidi totali, è appropriata una provetta da 6,5 mL. Il lavaggio di 200 μL di proteoliposomi (33,33 mg di lipidi/mL in totale; volume di pellet secco ~40 μL)28 per 3 x 6 mL di tampone diluisce i componenti esterni di un fattore 100 per ogni fase di lavaggio. Se si utilizzano tubi di dimensioni diverse, è consigliabile regolare di conseguenza il numero di lavaggi.
- Estrusione
- Giorno 3
- Rilevamento della sintesi di ATP mediante fluorescenza
- Miscelare i componenti di reazione fino a un volume finale di 120 μl (tabella 3) in una cuvetta di quarzo nero con una finestra di 3 x 5 mm e un volume interno minimo di 100 μl.
NOTA: Gli ionofori possono essere aggiunti per dissipare i gradienti di ioni elettrochimici. Una miscela di valinomicina e nigericina (1 μM ciascuna) dissipa efficacemente qualsiasi gradiente di protoni e potassio. - Preriscaldare il campione in un fluorimetro impostato a 30 °C e acquisire gli spettri di eccitazione di PercevalHR (eccitazione 400-520 nm, larghezza di banda 5 nm; emissione 550 nm, larghezza di banda 5 nm). Una volta che il segnale della sonda è costante, avviare la rete metabolica con l'aggiunta di un eccesso di L-arginina (5-10 mM) e glicerolo (400 μM) quando il riciclo dell'ATP è accoppiato alla sintesi del glicerolo-3-fosfato. Segui la reazione nel tempo.
- Miscelare i componenti di reazione fino a un volume finale di 120 μl (tabella 3) in una cuvetta di quarzo nero con una finestra di 3 x 5 mm e un volume interno minimo di 100 μl.
- Analisi dei dati
- Traccia il rapporto F500/F430 in funzione del tempo, che è un indicatore qualitativo del rapporto ATP/ADP. Per una valutazione più quantitativa della formazione di ATP, costruire una curva di calibrazione nei proteoliposomi o utilizzare un approccio complementare (ad esempio, quantificazione dell'ATP mediante chemiluminescenza28).
- Rilevamento della sintesi di ATP mediante fluorescenza
| Componente | Concentrazione finale |
| Buffer A | 50 mM KPi pH 7,0 |
| DTT | 2 mM |
| Na-ADP | 10 mM |
| MgCl2 | 10 mM |
| L-ornitina | 0,5 mM |
| Sonda fluorescente (PercevalHR o piranina) | 5,8 μM o 0,1 mM, rispettivamente |
| ArcA (Arginina deiminasi) | 1 μM |
| ArcB (Ornitina carbamiltransferasi) | 2 μM |
| ArcC1 (carbammato chinasi) | 5 μM |
| GlpK (glicerolo chinasi) | 1,6 μM |
| Proteoliposomi | 33,33 mg/mL di lipidi totali |
Tabella 2: Componenti di incapsulamento. I componenti sono elencati in ordine di aggiunta. Le proteine solubili si trovano nel tampone E; tutti gli altri componenti (ad eccezione del MgCl2, in acqua deionizzata) sono nel tampone A.
| Componente | Concentrazione finale |
| Buffer K | 50 mM KPi pH 7.0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.0 |
| Proteoliposomi (5,55 mg/mL di lipidi) | 2,7 mg/mL di lipidi |
| Ionofori (valinomicina, nigericina) | 1 μM ciascuno |
Tabella 3: Condizioni sperimentali. I componenti sono elencati in ordine di aggiunta. I proteoliposomi si trovano nel tampone N, gli ionofori nel DMSO o nell'EtOH.
4. Upscaling di una rete metabolica per vescicole di dimensioni micrometriche
- Giorno 1
- Preparazione del chip microfluidico
NOTA: Questo esperimento utilizza un dispositivo microfluidico sviluppato da Robinson et al.34. Altri modelli di chip microfluidici sono disponibili 35,36,37 e possono essere facilmente implementati in questo protocollo.- Tagliare un puntale per pipetta da 200 μl a un terzo dal fondo e inserire la parte inferiore del puntale in un dispositivo di intrappolamento microfluidico prefabbricato.
- Al serbatoio di ingresso del chip, aggiungere 400 μl di soluzione di β-caseina (2 mg/mL; vedere passaggio 1.5), facendo attenzione a prevenire l'introduzione di aria in questa fase. Posizionare un secchio per piastre da 96 pozzetti e aggiungere un tessuto di laboratorio in una centrifuga a provette coniche da tavolo. Posizionare il chip sopra il tessuto e centrifugare per 6 minuti a 900 × g per consentire la passivazione del chip microfluidico. Dopo la fase di centrifugazione, il livello del liquido deve essere uguale sul serbatoio di ingresso e sulla punta di uscita del chip microfluidico; Verificare la presenza di perdite dal chip. Incubare la soluzione di β-caseina nel chip microfluidico per almeno 30 minuti.
- Rimuovere la maggior parte della soluzione di passivazione senza introdurre aria e aggiungere 400 μl di tampone di lavaggio (tampone P). Posizionare il chip sul secchio per piastre a 96 pozzetti e centrifugare a 900 × g per 6 minuti. Lasciare il chip nella soluzione di lavaggio fino al momento dell'uso (per un massimo di 4 ore).
- Preparazione del chip microfluidico
- Preparato in gel per la produzione di proteo-GUVs
NOTA: La seguente descrizione è tratta e adattata da25,38.- Sciogliere lo 0,5% (p/p) di un agarosio a bassa temperatura gelificante (LGT) in acqua deionizzata riscaldando la soluzione nel microonde; Assicurati che l'agarosio si sia completamente sciolto ed evita di far bollire la soluzione. Conservare l'agarosio a 50 °C fino a nuovo utilizzo.
NOTA: L'agarosio disciolto può essere conservato a temperatura ambiente per diverse settimane. Per riutilizzare l'agarosio è sufficiente sciogliere il gel utilizzando un forno a microonde. - Prendi due diapositive obiettive e disegna il contorno del distanziatore sulle diapositive. Rendere i vetrini idrofili mediante pulizia al plasma, utilizzando plasma ad alto contenuto di ossigeno per 1 minuto.
- Aggiungere l'agarosio LGT sulla parte superiore del vetrino fino a ricoprirlo completamente con agarosio (~500 μL); Quindi, inclinare il vetrino con un angolo di 90° e drenare l'agarosio in eccesso su un fazzoletto. Lasciare i vetrini per 30 minuti a 50 °C.
- Prendere i proteoliposomi conservati nell'azoto liquido (sezione 3) e scongelarli con ghiaccio. Diluire le vescicole a 5 mg/mL di lipidi utilizzando il tampone Q.
NOTA: I proteoliposomi preparati nella sezione 3 non contengono proteine solubili e possono essere preparati con largo anticipo se conservati in azoto liquido. Quando si lavora con i proteoGUV, assicurarsi di filtrare sempre le soluzioni di lavoro per evitare l'intasamento del dispositivo microfluidico. - Sonicare i proteo-liposomi utilizzando un sonicatore a sonda portatile con sonda da 1 mm. Sonicare per 10 cicli di 0,5 s on e 0,5 s off al 70% di ampiezza. Tenere le vescicole, di seguito denominate proteoSUV, sul ghiaccio per 30 s e ripetere il processo di sonicazione 5 volte.
- Riempire una siringa da 100 μl (in un erogatore LCP portatile) con la sospensione proteo-SUV. Depositare 0,5 μL di goccioline di proteo-SUV sul gel di agarosio precedentemente preparato; Fare attenzione a non disturbare lo strato di agarosio e a mantenere una distanza sufficiente per evitare la fusione delle goccioline.
NOTA L'utilizzo di un dispenser LCP portatile consente la deposizione di goccioline in modo riproducibile, ma è possibile utilizzare anche sistemi di pipettaggio alternativi. La macchiatura con un capillare di vetro è meno adatta perché disturba il gel di agarosio essiccato. - Asciugare le goccioline del SUV in ~10 minuti utilizzando un flusso di azoto invece di aria compressa per ridurre la possibilità di ossidare i lipidi.
- Preparare 1 mL di un tampone concentrato 1,25x O (Tabella 4) nel tampone A e passare attraverso un filtro in acetato di cellulosa da 0,2 μm. Prelevare 800 μl della soluzione concentrata 1,25x e aggiungere gli enzimi solubili e le sonde alla concentrazione indicata nella Tabella 4. Utilizzare acqua deionizzata filtrata per rendere il volume finale di 1 ml.
- Preparare 100 μl di soluzione di rigonfiamento contenente tutti i componenti della Tabella 4, ad eccezione delle proteine e del glicerolo. Misurare l'osmolalità della soluzione di rigonfiamento utilizzando un osmometro per punto di congelamento calibrato a 3 punti.
NOTA: Preparare 100 μL di soluzione di rigonfiamento senza proteine e glicerolo per determinare con precisione l'osmolalità di questa soluzione. Il glicerolo, che è presente nella soluzione proteica, influenza l'osmolalità, ma, nei GUV, il glicerolo si diffonde rapidamente attraverso la membrana e porta solo a differenze osmotiche transitorie. - Assemblare la camera di rigonfiamento GUV realizzando un sandwich di due vetri obiettivo contenenti il gel e i SUV essiccati con un distanziatore in teflon di 1,5 o 3,0 mm di spessore in mezzo. Quindi, aggiungere la soluzione di rigonfiamento nella camera attraverso il piccolo foro sul lato usando una siringa e un ago.
NOTA: Il volume della soluzione di rigonfiamento può essere regolato variando i distanziatori da 1,5 a 3,0 mm.
- Sciogliere lo 0,5% (p/p) di un agarosio a bassa temperatura gelificante (LGT) in acqua deionizzata riscaldando la soluzione nel microonde; Assicurati che l'agarosio si sia completamente sciolto ed evita di far bollire la soluzione. Conservare l'agarosio a 50 °C fino a nuovo utilizzo.
- Rigonfiamento delle vescicole e raccolta di GUV
- Lasciare rigonfiare le vescicole mettendo la camera a 22 °C per almeno 30 minuti.
NOTA: Il rigonfiamento delle vescicole può essere seguito dalla microscopia ottica (ad esempio, un microscopio a contrasto di fase da tavolo o un microscopio a fluorescenza a campo largo) se le proteine o i lipidi sono marcati in fluorescenza. - Raccogliere i GUV dal gel applicando una leggera agitazione fisica picchiettando la camera su una superficie solida (ad esempio, banco da laboratorio); estrarre un terzo del volume e utilizzare la bolla d'aria risultante per indurre delicatamente il movimento al liquido rimanente, staccando così i GUV dal gel.
- Mentre i GUV si gonfiano, preparare il tampone P e abbinare l'osmolalità con la soluzione di rigonfiamento regolando la concentrazione di glucosio. Filtrare il tampone attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm.
NOTA: In generale, la soluzione di lavaggio e di substrato deve essere mantenuta entro ± 5 mosmol/kg. Qualsiasi soluzione che passa attraverso il chip deve essere molto pulita poiché i contaminanti possono ostruire i canali. Preparare tamponi freschi ogni volta o conservare i tamponi preparati a -20 °C e filtrare prima dell'uso.
- Lasciare rigonfiare le vescicole mettendo la camera a 22 °C per almeno 30 minuti.
- Intrappolamento dei GUV per esperimenti di microscopia
- Montare il chip microfluidico passivato sul tavolino del campione del microscopio. Verificare la presenza di eventuali difetti (ad es. perdite, aria intrappolata, canali intasati).
NOTA: Il controllo del chip può essere eseguito molto prima dell'uso in modo da poter preparare un nuovo chip, se necessario. - Collegare il tubo utilizzando un ago piegato all'uscita del serbatoio e collegare l'altra estremità a una siringa da 1 ml. Montare la siringa su una pompa e impostare la portata su un massimo di 10 μl/min.
- Rimuovere il tampone di lavaggio dal serbatoio (passaggio 4.1.1.3) e sostituirlo con un mezzo nuovo (tampone P). Avviare il flusso di tampone attraverso il chip infondendo attraverso la siringa a 1-10 μL/min. Lavare con almeno 80 μL di tampone di lavaggio osmoticamente bilanciato (Buffer P).
- Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dal serbatoio e aggiungere i (proteo)GUV al serbatoio. Regolare la portata a 0,1-1 μL/min per consentire ai GUV di fluire attraverso il chip. Monitora il chip nel tempo fino a quando non sono rimasti intrappolati abbastanza GUV nel chip.
NOTA: Le vescicole con quantità relativamente grandi (>20 mol%) di lipidi carichi come il fosfatidilglicerolo (PG), la fosfatidilserina (PS) o l'acido fosfatidico (PA) o i lipidi non che formano il doppio strato come la fosfatidiletanolammina (PE) vengono introdotti a una velocità di flusso inferiore attraverso il chip per prevenire lo scoppio. Le vescicole composte da fosfatidilcolina (PC) pura tendono ad essere più stabili. - Rimuovere la soluzione GUV in eccesso e aggiungere il tampone di lavaggio P, utilizzando un flusso costante di 0,1-1 μL/min, per sostituire il mezzo esterno e lavare i GUV intrappolati per almeno 1 ora per rimuovere i composti non incapsulati e abbassare la fluorescenza di fondo quando un fluoroforo è incapsulato. Monitorare la fluorescenza di fondo nel tempo; Se la fluorescenza di fondo non diminuisce, il chip potrebbe essere bloccato.
- Localizza le trappole con una quantità sufficiente di vescicole e salva le loro posizioni. Applicare le impostazioni sul microscopio (ad esempio, intensità del laser, guadagno, lunghezza d'onda) e avviare un esperimento di serie temporale.
- Aggiungere una soluzione di substrato osmoticamente bilanciata (tampone R) al serbatoio e iniziare una portata di 0,5 μL/min.
- Montare il chip microfluidico passivato sul tavolino del campione del microscopio. Verificare la presenza di eventuali difetti (ad es. perdite, aria intrappolata, canali intasati).
| Componenti del buffer L | ||
| Componente | 1,25 x concentrazione | Concentrazione lavorativa |
| Buffer A | 62,5 mM KPi pH 7,0 | 50 mM KPi pH 7,0 |
| Saccarosio | 125 mM | 100 mM |
| DTT | 2,5 mM | 2 mM |
| Na-ADP | 12,5 mM | 10 mM |
| MgCl2 | 12,5 mM | 10 mM |
| L-ornitina | 0,625 mM | 0,5 mM |
| Componenti di incapsulamento | ||
| Piranina o PercevalHR | 1 mM o 20 μM | |
| ArcA (Arginina deiminasi) | 1 μM | |
| ArcB (Ornitina carbamiltransferasi) | 2 μM | |
| ArcC1 (carbammato chinasi) | 5 μM | |
Tabella 4: Buffer O e componenti di incapsulamento. I componenti sono elencati in ordine di aggiunta. Tutti i componenti (ad eccezione del MgCl2, in acqua deionizzata) sono nel tampone A. I componenti di incapsulamento sono elencati in ordine di aggiunta. Tutte le proteine idrosolubili si trovano nel tampone E.
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Representative Results
La ricostituzione delle proteine solubilizzate di membrana nei liposomi richiede la destabilizzazione delle vescicole preformate. L'aggiunta di basse quantità di Triton X-100 si traduce inizialmente in un aumento dell'assorbanza a 540 nm (A540) a causa di un aumento della dispersione della luce dovuta al rigonfiamento delle vescicole (Figura 4). Il valore massimo di A540 è il punto in cui i liposomi sono saturi di detergente (Rsat), dopodiché qualsiasi ulteriore aggiunta di Triton X-100 comporterà una parziale solubilizzazione delle vescicole. A Rsol, i liposomi sono completamente solubilizzati (Figura 4). Per la ricostituzione delle proteine di membrana, in genere si utilizzano vescicole destabilizzate al 60% oltre Rsat (indicato da freccia).
La proteina di membrana ricostituita ArcD viene utilizzata per trasportare la L-arginina all'interno e la L-ornitina fuori dalle vescicole e viene utilizzata insieme agli enzimi incapsulati ArcA, ArcB e ArcC per riciclare l'ATP dall'ADP e dal fosfato inorganico. GlpT è un antiporter del glicerolo 3-fosfato/fosfato che, insieme al GlpK, è necessario per la sintesi (e l'escrezione) del glicerolo-3-fosfato dal glicerolo più l'ATP prodotto dalla degradazione della L-arginina. L'aggiunta di 5 mM di L-arginina a t = 0 ai proteoliposomi determina un forte aumento del rapporto tra la fluorescenza PercevalHR a 500 e l'eccitazione39 a 430 nm, che riflette il rapporto ATP/ADP all'interno delle vescicole (Figura 5). Dopo l'aggiunta di glicerolo, l'ATP viene utilizzato per la sintesi del glicerolo 3-fosfato, che si traduce in un abbassamento del rapporto ATP/ADP28. La degradazione della L-arginina porta anche a variazioni del pH, che possono essere quantificate utilizzando la piranina o la pHluorin27.
Figura 5: Riciclo dell'ATP da parte della via di degradazione della L-arginina. I LUV a 2,7 mg di lipidi/mL vengono posti in una cuvetta e viene registrato il rapporto di fluorescenza a 500 nm e 430 nm. 5 mM di L-arginina vengono aggiunti a t = 0. Il rapporto F500/F430 è una misura del rapporto ATP/ADP all'interno delle vescicole. Abbreviazione: LUV = grandi vescicole unilamellari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I LUV produttori di ATP possono anche essere utilizzati per formare GUV. La reidratazione dei proteo-LUV essiccati su un gel di agarosio LGT provoca la formazione di vescicole di dimensioni micrometriche (Figura 6). La formazione di proteo-GUV all'interno delle macchie LUV essiccate dipende fortemente dalla concentrazione locale di lipidi e dal grado di disidratazione. Alcune aree hanno grandi chiazze di GUV, mentre in altri punti della stessa gocciolina non si possono formare GUV o pochi. La formazione di GUV attraverso il rigonfiamento assistito da agarosio LGT si traduce in una gamma di dimensioni GUV, tipicamente da pochi micrometri a più di 50 μm.
Figura 6: Immagini DIC di proteoGUV formati da rigonfiamento assistito da gel. Barra della scala = 25 μm. Abbreviazioni: DIC = contrasto interferenziale differenziale; GUVs = vescicole unilamellari giganti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I GUV vengono raccolti e intrappolati in un dispositivo microfluidico basato su PDMS passivato a β-caseina (Figura 7). Il dispositivo è progettato in modo tale che molte vescicole possano essere intrappolate e analizzate all'interno di un singolo esperimento e il dispositivo viene utilizzato per controllare l'ambiente esterno (portata, composizione del tampone, ecc.) 34. Anche quando la resa dei proteo-GUV è bassa, il flusso costante di GUV attraverso il chip microfluidico consente la raccolta di molte vescicole. Una volta intrappolato un numero sufficiente di GUV, il sistema viene lavato con un tampone osmoticamente bilanciato per rimuovere componenti esterni come proteine solubili, piccole molecole e sonde fluorescenti. Il tampone di lavaggio viene quindi sostituito da una soluzione di substrato di uguale osmolalità contenente 50 mM KPi (pH 7,0), quantità variabili di glucosio (per regolare l'osmolalità) e substrati come 10 mM di L-arginina. Viene eseguito un esperimento di serie temporali su diverse trappole del chip microfluidico e le immagini vengono scattate ogni 90 s (eccitazione di 405 nm e 488 nm quando si utilizza PercevalHR). Inoltre, viene scattata un'immagine in campo chiaro in ogni punto temporale. Il rapporto tra le intensità di emissione dopo l'eccitazione a 488 e 405 nm è una misura del rapporto ADP/ATP nelle vescicole.
Figura 7: Intrappolamento delle vescicole con il chip microfluidico. (A) Intrappolamento delle vescicole, accompagnato dalla capacità di controllare l'ambiente esterno e la velocità di flusso. (B) ProteoGUV intrappolati in un dispositivo microfluidico ed eccitati con un laser a 405 nm (verde) e un laser a 488 nm (rosso). L'emissione per entrambi i canali è misurata a >500 nm. L'immagine in campo chiaro consente la visualizzazione delle vescicole senza fluorescenza. Barra della scala = 25 μm. Abbreviazione: GUVs = vescicole giganti-unilamellari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentiamo un protocollo per la sintesi di proteine (di membrana) contenenti vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche (proteoLUVs), e la conversione di proteoLUV in vescicole giganti-unilamellari (proteoGUVs). Il protocollo dovrebbe essere applicabile per la ricostituzione di altre proteine di membrana 13,19,30,40 e l'incapsulamento di reti metaboliche diverse dalle vie di degradazione della L-arginina e di sintesi del glicerolo 3-fosfato qui presentate.
La ricostituzione delle proteine di membrana nei liposomi generalmente produce un orientamento casuale delle proteine all'interno della membrana lipidica. Per ArcD e Glpt, l'orientamento non ha importanza, perché le proteine operano in modo bidirezionale e i soluti si muovono a seconda del segno del potenziale elettrochimico totale. Per le proteine che funzionano in una direzione, metà delle molecole non sarà disponibile per l'attività quando il loro orientamento è 50/50.
L'estrusione delle vescicole attraverso un filtro in policarbonato restringe la distribuzione dimensionale e le vescicole diventano più omogenee quanto più piccola è la dimensione dei pori dei filtri. Tuttavia, le vescicole più piccole hanno il prezzo di avere un volume minore e quindi un numero molto piccolo di proteine (enzimi, proteine di membrana) per vescicola. Per minimizzare la frazione di LUV che hanno uno o più componenti mancanti, la concentrazione delle proteine può essere regolata come mostrato nella Figura 3A, B, ma con vescicole molto piccole gli effetti stocastici sono inevitabili.
Il metodo di rigonfiamento assistito da gel si basa sulla deposizione di vescicole sonicate (SUV) su una superficie di agarosio essiccata. Durante il processo di essiccazione, si forma un gradiente di concentrazione di vescicole e la concentrazione lipidica è la più alta alla periferia del punto. Ciò è dovuto a un fenomeno noto come effetto macchia di caffè41,42. Di conseguenza, solo una piccola regione all'interno della macchia contiene una concentrazione di lipidi adatta alla formazione di GUV. Le macchie lipidiche circolari e concentrate in modo irregolare provocano ampie aree inutilizzate che non sono disponibili per la fusione delle vescicole; quindi, l'efficienza della formazione di GUV diventa bassa in questo approccio. Per aumentare la resa dei GUV, si dovrebbe mirare a una deposizione lipidica uniforme, che può essere ottenuta mediante spin coating42 o sfruttando l'effetto della macchia di caffè41.
Ulteriori note sul protocollo:
Si deve fare attenzione che diverse proteine di membrana (>10) siano ricostituite in media per vescicola per evitare effetti stocastici. Pertanto, evitare rapporti lipidi/proteine superiori a 400:1 p/p. Si assume un orientamento casuale per la maggior parte delle proteine.
Idealmente, il volume delle proteine totali di membrana è il più piccolo possibile e comunque non supera il 10-20% del volume del liposoma. L'aggiunta di volumi maggiori introdurrà più detersivo e la maggior parte dei liposomi preformati può lisi, il che può avere un effetto negativo sull'efficienza della ricostituzione.
Il pre-bilanciamento dell'estrusore con la soluzione appropriata è importante per evitare la diluizione dei componenti durante l'incapsulamento. Idealmente, la soluzione di preequilibrio dovrebbe contenere anche gli enzimi solubili, ma l'inclusione di enzimi può essere troppo costosa a causa del volume relativamente grande necessario per il pre-equilibrio dell'estrusore. Pertanto, in genere omettiamo questi componenti e accettiamo una diluizione del 5% degli enzimi.
Gli ionofori devono essere aggiunti alle miscele contenenti proteoliposomi perché le molecole sono altamente idrofobiche e possono adsorbirsi sulle superfici se non sono presenti vescicole. Bisogna fare attenzione che il volume di solvente aggiunto sia basso (<1% del volume totale di reazione). I controlli vengono effettuati per verificare che i solventi non influenzino le reti metaboliche nelle vescicole. Concentrazioni di ionofori di circa 1 μM sono generalmente sicure per concentrazioni lipidiche totali di ~3 mg/mL.
Bisogna fare attenzione ad asciugare accuratamente le goccioline. Se le goccioline non sono sufficientemente asciutte, la formazione di GUV è meno efficiente in quanto i lipidi formeranno aggregati lipidici e gli MLV possono formarsi quando viene aggiunta la soluzione di rigonfiamento.
Il glucosio viene utilizzato per far corrispondere l'osmolarità del mezzo esterno a quello interno; quest'ultimo contiene saccarosio al posto del glucosio per aumentare la densità delle vescicole e facilitare così la sedimentazione delle GUV. Inoltre, il glucosio nell'ambiente esterno aumenta il contrasto di fase, rendendo la vescicola più facilmente visibile.
Gli effetti stocastici sono molto meno un problema con i GUV; Ma qui, il rapporto superficie-volume può diventare inaccettabilmente basso in modo tale che il numero di proteine di membrana (ad esempio, trasportatori) diventa limitante per la rete metabolica interna. Il metodo descritto in questo protocollo non consente un controllo preciso sulle dimensioni dei proteoGUV, ma la maggior parte rientra nell'intervallo di dimensioni di 5-50 μm.
In conclusione, il lavoro qui presentato fornisce una panoramica completa della ricostituzione delle proteine di membrana e dell'incapsulamento enzimatico in vescicole lipidiche di varie dimensioni. Dimostriamo la costruzione di vescicole funzionali per la sintesi di ATP e di elementi costitutivi da semplici precursori come aminoacidi e glicerolo. La ricostituzione delle proteine di membrana nei GUV rimane impegnativa, ma i protocolli qui presentati aprono la strada a ulteriori sviluppi nella ricerca bottom-up sulla biologia sintetica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Aditya Iyer per la clonazione del gene pBAD-PercevalHR e Gea Schuurman-Wolters per aver contribuito alla produzione e alla purificazione delle proteine. La ricerca è stata finanziata dal programma di gravitazione NWO "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
| Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
| D(+)-Glucose | Formedium | - | |
| D(+)-Sucrose | Formedium | - | |
| DDM | Glycon | D97002 -C | |
| Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
| Glycerol | BOOM | 51171608 | |
| Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
| Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
| Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
| Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
| Light microscope | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
| Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
| Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
| Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
| Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
| Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
| Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
| Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
| UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
| β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
References
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