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Biochemistry

नैनो- और माइक्रोमीटर के आकार के पुटिकाओं में आउट-ऑफ-इक्विलिब्रियम मेटाबोलिक नेटवर्क का निर्माण

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

हम झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन और उप-माइक्रोमीटर और माइक्रोमीटर आकार के लिपिड पुटिकाओं में एंजाइमों और अन्य पानी में घुलनशील घटकों को एनकैप्सुलेट करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हम पुटिकाओं जटिल प्रोटीन नेटवर्क में शामिल करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, जिसमें शुद्ध घटकों का उपयोग करके अभिन्न झिल्ली प्रोटीन, एंजाइम और प्रतिदीप्ति आधारित सेंसर शामिल होते हैं। यह विधि बायोरिएक्टरों के डिजाइन और निर्माण और जटिल आउट-ऑफ-संतुलन चयापचय प्रतिक्रिया नेटवर्क के अध्ययन के लिए प्रासंगिक है। हम पहले से विकसित प्रोटोकॉल के अनुसार बड़े यूनिलामेलर पुटिकाओं (एलयूवी) में (कई) झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन करके शुरू करते हैं। फिर हम फ्रीज-पिघलना-एक्सट्रूज़न के माध्यम से शुद्ध एंजाइमों, चयापचयों और प्रतिदीप्ति आधारित सेंसर (फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंजक) के मिश्रण को समाहित करते हैं और सेंट्रीफ्यूजेशन और/या आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा गैर-निगमित घटकों को हटाते हैं। चयापचय नेटवर्क के प्रदर्शन को प्रतिदीप्ति रीडआउट द्वारा एटीपी/एडीपी अनुपात, मेटाबोलाइट एकाग्रता, आंतरिक पीएच, या अन्य मापदंडों की निगरानी करके वास्तविक समय में मापा जाता है। 100-400 एनएम व्यास के हमारे झिल्ली प्रोटीन युक्त पुटिकाओं को मौजूदा लेकिन अनुकूलित प्रक्रियाओं का उपयोग करके विशाल-यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) में परिवर्तित किया जा सकता है। दृष्टिकोण माइक्रोमीटर-आकार के पुटिकाओं में घुलनशील घटकों (एंजाइम, मेटाबोलाइट्स, सेंसर) को शामिल करने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार परिमाण के आदेशों द्वारा बायोरिएक्टर की मात्रा को बढ़ाता है। जीयूवी युक्त चयापचय नेटवर्क ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में फंस गए हैं।

Introduction

नीचे-ऊपर सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र (न्यूनतम) कोशिकाओं 1,2 और जैव प्रौद्योगिकी 3,4 या जैव चिकित्सा प्रयोजनों 5,6,7,8 के लिए चयापचय bioreactors के निर्माण पर केंद्रित है. सिंथेटिक कोशिकाओं का निर्माण एक अनूठा मंच प्रदान करता है जो शोधकर्ताओं को देशी वातावरण की नकल करने वाली अच्छी तरह से परिभाषित स्थितियों में प्रोटीन का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जिससे प्रोटीन औरप्रतिक्रिया नेटवर्क 9 के आकस्मिक गुणों और छुपा जैव रासायनिक कार्यों की खोज को सक्षम किया जा सकता है। एक स्वायत्त रूप से काम करने वाले सिंथेटिक सेल की दिशा में एक मध्यवर्ती कदम के रूप में, मॉड्यूल विकसित किए जाते हैं जो चयापचय ऊर्जा संरक्षण, प्रोटीन और लिपिड संश्लेषण, और होमियोस्टेसिस जैसे जीवित कोशिकाओं की आवश्यक विशेषताओं को पकड़ते हैं। इस तरह के मॉड्यूल न केवल जीवन की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए लेकिन यह भी चिकित्सा8 और जैव प्रौद्योगिकी10 के क्षेत्र में संभावित अनुप्रयोगों है.

ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन वस्तुतः किसी भी चयापचय नेटवर्क के केंद्र में होते हैं क्योंकि वे अणुओं को कोशिका के अंदर या बाहर ले जाते हैं, संकेत देते हैं, और पर्यावरण की गुणवत्ता का जवाब देते हैं, और कई बायोसिंथेटिक भूमिकाएं निभाते हैं। इस प्रकार, सिंथेटिक कोशिकाओं में चयापचय मॉड्यूल की इंजीनियरिंग के लिए ज्यादातर मामलों में विशिष्ट लिपिड और उच्च अखंडता (कम पारगम्यता) से बना झिल्ली बाईलेयर में अभिन्न और / या परिधीय झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन की आवश्यकता होती है। इन झिल्ली प्रोटीन की हैंडलिंग चुनौतीपूर्ण है और विशिष्ट ज्ञान और प्रयोगात्मक कौशल की आवश्यकता है.

फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं के भीतर झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन करने के लिए कई तरीकों का विकास किया गया है, अक्सर समारोह11,12, विनियमन13, गतिज गुण14,15, लिपिड निर्भरता15,16, और/या स्थिरता17 एक विशिष्ट प्रोटीन के अध्ययन के उद्देश्य से। इन विधियों लिपिड18 की उपस्थिति में जलीय मीडिया में डिटर्जेंट घुलनशील प्रोटीन के तेजी से कमजोर पड़ने शामिल, डिटर्जेंट-अस्थिर लिपिड पुटिकाओं और डिटर्जेंट के अवशोषण के साथ डिटर्जेंट-घुलनशील प्रोटीन सेते द्वारा डिटर्जेंट को हटाने(रों) polystyrene मोती19 पर, या डायलिसिस या आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा डिटर्जेंट को हटाने20. कार्बनिक सॉल्वैंट्स लिपिड पुटिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए, तेल-पानी interphases21 के गठन के माध्यम से, लेकिन अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के बहुमत निष्क्रिय कर रहे हैं जब इस तरह के सॉल्वैंट्स के संपर्क में हैं.

हमारी प्रयोगशाला में, हम ज्यादातर बड़े-यूनिलामेलर पुटिकाओं (एलयूवी)19बनाने के लिए डिटर्जेंट-अवशोषण विधि द्वारा झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन करते हैं। यह विधि कई झिल्ली प्रोटीन के सह-पुनर्गठन और एंजाइमों, चयापचयों और जांच22,23 के पुटिका लुमेन में एनकैप्सुलेशन की अनुमति देती है। झिल्ली प्रोटीन युक्त LUVs विशाल unilamellar vesicles (GUVs) के साथ / पानी में घुलनशील घटकों के encapsulation के बिना, या तो electroformation24 या जेल सहायता प्राप्त सूजन25 और झिल्ली प्रोटीन26 की अखंडता को संरक्षित करने के लिए विशिष्ट शर्तों का उपयोग कर में परिवर्तित किया जा सकता है.

यह पत्र एक आउट-ऑफ-इक्विलिब्रियम मेटाबोलिक नेटवर्क के एलयूवी में पुनर्गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो एल-आर्जिनिन के टूटने के माध्यम से एटीपी को एल-ऑर्निथिन27 में पुन: उत्पन्न करता है। एटीपी का गठन ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट (जी 3 पी) के उत्पादन के लिए युग्मित है, फॉस्फोलिपिड संश्लेषण 22,28के लिए एक महत्वपूर्ण बिल्डिंग ब्लॉक। चयापचय मार्ग में दो अभिन्न झिल्ली प्रोटीन, एक आर्जिनिन / ऑर्निथिन (एआरसीडी) और एक जी 3 पी / पीआई एंटीपोर्टर (जीएलपीटी) होते हैं। इसके अलावा, एटीपी के पुनर्चक्रण के लिए तीन घुलनशील एंजाइम (ArcA, ArcB, ArcC) की आवश्यकता होती है, और GlpK का उपयोग ग्लिसरॉल को ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट में बदलने के लिए किया जाता है, L-arginine के टूटने से ATP का उपयोग करके, मार्ग के योजनाबद्ध अवलोकन के लिए चित्र 1 देखें। यह प्रोटोकॉल लिपिड या प्रोटीन के संश्लेषण या कोशिकाओं के विभाजन के लिए और भी जटिल प्रतिक्रिया नेटवर्क के भविष्य के निर्माण के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है। पुटिकाओं की लिपिड संरचना अभिन्न झिल्ली प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता की गतिविधि का समर्थन करती है और पुटिकाओं 27,29,30में या बाहर विविध अणुओं के परिवहन के लिए अनुकूलित किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: एटीपी उत्पादन और ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट संश्लेषण और उत्सर्जन के लिए मार्ग का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संक्षेप में, शुद्ध झिल्ली प्रोटीन (डोडेसिल-β-डी-माल्टोसाइड, डीडीएम में घुलनशील) को पूर्वनिर्मित लिपिड पुटिकाओं में जोड़ा जाता है जिन्हें ट्राइटन एक्स -100 के साथ अस्थिर किया गया है, जो झिल्ली में प्रोटीन के सम्मिलन की अनुमति देता है। डिटर्जेंट अणुओं को बाद में (धीरे-धीरे) सक्रिय पॉलीस्टायर्न मोतियों के अतिरिक्त हटा दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अच्छी तरह से सील प्रोटीओलिपोसोम का निर्माण होता है। घुलनशील घटकों को तब पुटिकाओं में जोड़ा जा सकता है और फ्रीज-पिघलना चक्रों के माध्यम से समझाया जा सकता है, जो झिल्ली संलयन की प्रक्रिया में अणुओं को फँसाता है। प्राप्त पुटिकाएं अत्यधिक विषम होती हैं और कई मल्टीलामेलर होती हैं। फिर उन्हें 400, 200, या 100 एनएम के छिद्र आकार के साथ एक पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से निकाला जाता है, जो अधिक समान आकार के पुटिकाओं का उत्पादन करता है; छिद्र का आकार जितना छोटा होता है, पुटिकाओं का आकार उतना ही अधिक सजातीय और एकमिलामेलर होता है, लेकिन एक छोटे आंतरिक आयतन की कीमत पर। गैर-निगमित प्रोटीन और छोटे अणुओं को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा बाहरी समाधान से हटा दिया जाता है। प्रोटीओएलयूवी को जेल-असिस्टेड सूजन द्वारा माइक्रोमीटर आकार के पुटिकाओं में परिवर्तित किया जा सकता है, और इन प्रोटीओजीयूवी को तब सूक्ष्म लक्षण वर्णन और हेरफेर के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप में एकत्र और फंसाया जाता है। चित्रा 2 पूर्ण प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध अवलोकन दिखाता है।

Figure 2
चित्रा 2: झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन और उप-माइक्रोमीटर (एलयूवी) और माइक्रोमीटर आकार (जीयूवी) के लिपिड पुटिकाओं में एंजाइमों और पानी में घुलनशील घटकों को एनकैप्सुलेट करने के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पुनर्गठन और एनकैप्सुलेशन प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काम करते हैं और प्रोटीन की कार्यक्षमता को बरकरार रखा जाता है, लेकिन प्रोटीओएलयूवी और प्रोटीओजीयूवी आकार में विषम हैं। माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण31,32 माइक्रोमीटर आकार के पुटिकाओं के गठन की अनुमति देते हैं जो आकार में अधिक सजातीय होते हैं, लेकिन झिल्ली प्रोटीन का कार्यात्मक पुनर्गठन आमतौर पर संभव नहीं होता है क्योंकि बाइलेयर में अवशिष्ट विलायक प्रोटीन को निष्क्रिय करता है। प्रोटीओएलयूवी आकार में 100 से 400 एनएम तक होते हैं, और एंजाइमों की कम सांद्रता पर, एनकैप्सुलेशन अपूर्ण चयापचय मार्गों (स्टोकेस्टिक प्रभाव; चित्र 3 देखें) के साथ पुटिकाओं को जन्म दे सकता है। LUVs विशिष्ट चयापचय मॉड्यूल के निर्माण के लिए आदर्श हैं, जैसा कि एटीपी के उत्पादन और G3P जैसे बिल्डिंग ब्लॉक्स के लिए यहां दिखाया गया है। इस तरह के प्रोटीओएलयूवी को संभावित रूप से जीयूवी में समझाया जा सकता है और मेजबान पुटिकाओं के लिए ऑर्गेनेल जैसे डिब्बों के रूप में काम किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: 100, 200, या 400 एनएम के व्यास के साथ प्रति पुटिका अणुओं की संख्या। (ए) जब समझाया प्रोटीन (एंजाइम, जांच) 1-10 माइक्रोन की सीमा में हैं। (बी) पुनर्गठन 1 से 1,000, 1 से 10,000, और 1 से 100,000 झिल्ली प्रोटीन प्रति लिपिड (मोल / मोल) पर किया जाता है। हम यह धारणा बनाते हैं कि अणुओं को संकेतित सांद्रता पर समझाया जाता है और इन प्रोटीन-से-लिपिड अनुपात में झिल्ली में शामिल किया जाता है। कुछ एंजाइमों के लिए, हमने देखा है कि वे झिल्ली से बंधते हैं, जो पुटिकाओं में उनकी स्पष्ट एकाग्रता को बढ़ा सकते हैं। संक्षिप्तीकरण: LPR = लिपिड-प्रोटीन-अनुपात कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. सामान्य तैयारी

  1. रसायन
    1. पूर्वनिर्मित लिपोसोम बनाने के लिए सीएचसीएल3 में लिपिड (पाउडर के रूप में) को 25 मिलीग्राम/एमएल तक भंग करें।
      नोट: ताजा लिपिड स्टॉक तैयार करना बेहतर होता है, लेकिन स्टॉक समाधान कुछ हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत किया जा सकता है। पाउडर के रूप में लिपिड के साथ काम करना सीएचसीएल3 में पहले से घुलनशील लिपिड का उपयोग करने से अधिक सटीक है। सीएचसीएल3 को ग्लास पिपेट और/या सीरिंज का उपयोग करके संभाला जाना चाहिए और ग्लास कंटेनर में संग्रहीत किया जाना चाहिए क्योंकि सीएचसीएल3 प्लास्टिक को भंग कर देता है।
    2. 50 एमएम केपीआई (बफर ए, तालिका 1 देखें) में एनकैप्सुलेशन प्रक्रिया के लिए छोटे अणुओं (न्यूक्लियोटाइड्स, अमीनो एसिड, प्रतिदीप्ति जांच) को भंग करें और पीएच को 7.00 ± 0.01 में समायोजित करें। मैग्नीशियम फॉस्फेट अवक्षेप के गठन से बचने के लिए विआयनीकृत पानी में MgCl2 भंग.
      नोट: स्टॉक समाधान प्रयोग के दिन ताजा तैयार किया जाता है, जो डीटीटी, के अपवाद के साथ, कुछ हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
    3. 100-500 माइक्रोन के स्टॉक एकाग्रता पर डीएमएसओ या ईटीओएच में आयनोफोरस (जैसे, वैलिनोमाइसिन, नाइजेरिसिन) को भंग करें। कुछ हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; वाष्पीकरण से बचें।
      नोट: डीएमएसओ अस्थिर नहीं है और इस प्रकार ईटीओएच पर पसंद किया जाता है। शीशियों की सतह पर आयनोफोर के आसंजन से बचने के लिए प्लास्टिक की शीशियों के बजाय कांच का उपयोग करें।
  2. बफ़र्स
    1. प्रयोग के दिन ताजा बफर तैयार करें(तालिका 1)। 24 घंटे से अधिक समय तक स्टोर न करें।
  3. घुलनशील प्रोटीन का शुद्धिकरण
    1. एक्सप्रेस ArcA, ArcB, ArcC (हम ArcC1 नामक एक विशिष्ट संस्करण का उपयोग करते हैं), PercevalHR, और GlpK जैसा कि पहले 27,28,33 वर्णित है। सेल लाइसिस बफर में 10% वी/वी ग्लिसरॉल जोड़ना सुनिश्चित करें, जो प्रोटीन की स्थिरता को बढ़ाता है। घुलनशील प्रोटीन को शुद्ध करें जैसा कि 27,28,33 वर्णित है और शीघ्र ही इसके बाद रिपोर्ट किया गया है।
    2. पिघलना 10 एमएल सेल lysate (~ 5 ग्राम गीला वजन) एक बर्फ के पानी के स्नान में. इस बीच, धोने के लिए विआयनीकृत पानी (12 सीवी) और बफर बी (4 सीवी) के साथ गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ (20 एमएल क्षमता) पर 2 एमएल (1 सीवी) नी2 + -सेफरोज राल लागू करें। पिघले हुए लाइसेट को बर्फ में स्थानांतरित करें; बर्फ पर काम करें, जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो।
    3. पिघले हुए लाइसेट में 10 मिमी की अंतिम एकाग्रता में इमिडाज़ोल जोड़ें, फिर गुरुत्वाकर्षण-प्रवाह स्तंभ पर समाधान डालें। कोमल नट के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. 1 घंटे के बाद, प्रवाह को त्यागें और बफर सी (20 सीवी) के साथ राल धो लें।
    5. बफर डी के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें, पहले क्षालन चरण के लिए 60% सीवी का उपयोग करें, इसके बाद 40% सीवी के 4-6 चरण हों।
    6. प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें और 5 मिमी की अंतिम एकाग्रता में ना-ईडीटीए जोड़ें।
    7. एक प्रशीतित टेबलटॉप अपकेंद्रित्र (अधिकतम गति, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) में शुद्ध प्रोटीन को स्पिन करें। बफर ई पूल का उपयोग करके आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध करें क्षालन अंशों को एक साथ पूल करें और उन्हें 30 केडीए के कट-ऑफ के साथ एक केंद्रित फिल्टर के साथ ~ 10 मिलीग्राम / एमएल पर ध्यान केंद्रित करें। उचित आकार (~ 20 माइक्रोन) के एलिकोट तैयार करें, तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश-फ्रीज, और बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: एनकैप्सुलेशन के लिए आवश्यक मात्रा को कम करने के लिए एंजाइमों को 50-100 माइक्रोन पर केंद्रित करना महत्वपूर्ण है।
  4. झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि
    1. Overexpress ArcD और GlpT जैसा कि पहले 22,27,33 वर्णित है। सेल लाइसिस बफर में 10% वी/वी ग्लिसरॉल जोड़ना सुनिश्चित करें; एआरसीडी के शुद्धिकरण के लिए, बफर में 2 एमएम कम करने वाले एजेंट (जैसे, डीटीटी) शामिल करें। नी2 + -Sepharose क्रोमैटोग्राफी द्वारा आत्मीयता-टैग प्रोटीन को शुद्ध करें।
      1. बर्फ के पानी के स्नान में कच्चे झिल्ली पुटिकाओं (कुल झिल्ली प्रोटीन का 10-20 मिलीग्राम) का एक विभाज्य पिघलें।
        नोट: एक बार पिघलने के बाद, हमेशा बर्फ पर काम करें जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो। इस खंड में उपयोग किए गए बफ़र्स के लिए तालिका 1 देखें।
      2. झिल्ली पुटिकाओं को बफर एफ (आर्कडी) या बफर जी (जीएलपीटी) में 6 एमएल की अंतिम मात्रा में जोड़ें। कोमल नट के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूना सेते हैं।
      3. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (337,000 × ग्राम, 30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा झिल्ली मलबे से घुलनशील झिल्ली प्रोटीन को अलग करें। इस बीच, विआयनीकृत पानी (40 सीवी) और बफर एच (आर्कडी) या बफर I (जीएलपीटी) के 20 सीवी के साथ गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ (10 एमएल क्षमता) पर नी2 + -सेफरोज राल के 0.25 एमएल (1 सीवी) लागू करें।
      4. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ पर घुलनशील प्रोटीन डालो और 10 मिमी की अंतिम एकाग्रता में इमिडाज़ोल जोड़ें। कोमल नट के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      5. 1 घंटे के बाद, फ्लोथ्रू को त्यागें और बफर जे (आर्कडी) या बफर के (जीएलपीटी) के 20 सीवी के साथ राल धो लें।
      6. बफर एल (आर्कडी) या बफर एम (जीएलपीटी) के साथ 60% सीवी (1सेंट) और 40% सीवी (2एनडी -6वें) चरणों में झिल्ली प्रोटीन को एल्यूट करें।
      7. प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें और धारा 2.2 तक जारी रखें। झिल्ली पुनर्गठन के लिए।
        नोट: आकार-बहिष्करण शुद्धि आवश्यक रूप से झिल्ली प्रोटीन के लिए नहीं किया जाता है क्योंकि झिल्ली पुनर्गठन एक समान शुद्धि पैदा करता है। चरण 1.4 और 2.2 काम के 1 दिन में किया जा सकता है. सुबह में प्रोटीन शुद्धि (चरण 1.4) के साथ शुरू करें और दोपहर में पुनर्गठन (चरण 2.2) के साथ जारी रखें। पुनर्गठन अगले दिन समाप्त होता है (विवरण के लिए खंड 2.2 देखें)। स्टॉपिंग प्वाइंट: शुद्ध और डीडीएम-घुलनशील आर्कडी और जीएलपीटी को बाद में उपयोग के लिए -80 ओसी पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन यह सभी झिल्ली प्रोटीन के लिए सच नहीं है। उपयुक्त आकार (50-200 माइक्रोन) के एलिकोट तैयार करें, तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश-फ्रीज, और बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ये प्रोटीन कई महीनों तक सक्रिय रहते हैं जब 10% v/v ग्लिसरॉल की उपस्थिति में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
  5. निष्क्रियता प्रयोजनों के लिए β-कैसिइन की तैयारी
    1. विआयनीकृत पानी के 20 एमएल में 100 मिलीग्राम β-कैसिइन को फिर से निलंबित करें और 1 एम एनएओएच के साथ अनुमापन करें जब तक कि β-कैसिइन पूरी तरह से भंग न हो जाए। फिर, पीएच को 7.0 में समायोजित करने के लिए 1 एम एसिटिक एसिड जोड़ें और आयतन को विआयनीकृत पानी के साथ 50 एमएल तक भरें। एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें और 500 माइक्रोन के एलिकोट बनाएं।
      नोट: β-कैसिइन को 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप को बंद करने से β-कैसिइन समुच्चय से बचने के लिए उपयोग करने से पहले फिर से β-कैसिइन को फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है।

बफ़र संयोजन
बफर ए 50 मिमी केपीआई पीएच 7.0
बफर बी 50 एमएम केपीआई, 100 एमएम केसीएल, 10% वी/वी ग्लिसरॉल, 10 एमएम इमिडाजोल, पीएच 7.5
बफर सी 50 एमएम केपीआई, 100 एमएम केसीएल, 10% वी/वी ग्लिसरॉल, 50 एमएम इमिडाजोल, पीएच 7.5
बफर डी 50 एमएम केपीआई, 100 एमएम केसीएल, 10% वी/वी ग्लिसरॉल, 500 एमएम इमिडाजोल, पीएच 7.5
बफर ई 50 एमएम केपीआई, 100 एमएम केसीएल, 10% वी/वी ग्लिसरॉल, पीएच 7.0
बफर एफ 50 एमएम केपीआई, 100 एमएम केसीएल, 0.5% डब्ल्यू / वी डीडीएम, 10% वी / वी ग्लिसरॉल, 2 एमएम β-मर्कैप्टोथेनॉल, पीएच 7.5
बफर जी 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 0.5% डब्ल्यू/वी डीडीएम, 20% वी/वी ग्लिसरॉल, पीएच 8
बफर एच 50 एमएम केपीआई, 100 एमएम केसीएल, 0.02% डब्ल्यू / वी डीडीएम, 10% वी / वी ग्लिसरॉल, 2 एमएम β-मर्काप्टोथेनॉल, 10 एमएम इमिडाजोल, पीएच 7.5
बफर I 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 0.04% डब्ल्यू/वी डीडीएम, 20% वी/वी ग्लिसरॉल, 10 एमएम इमिडाजोल, पीएच 8.0
बफर जे 50 एमएम केपीआई, 200 एमएम केसीएल, 0.02% डब्ल्यू / वी डीडीएम, 10% वी / वी ग्लिसरॉल, 2 एमएम β-मर्कैप्टोथेनॉल, 50 एमएम इमिडाजोल, पीएच 7.5
बफर K 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 0.04% डब्ल्यू/वी डीडीएम, 20% वी/वी ग्लिसरॉल, 50 एमएम इमिडाजोल, पीएच 8
बफर एल 50 एमएम केपीआई, 200 एमएम केसीएल, 0.02% डब्ल्यू / वी डीडीएम, 10% वी / वी ग्लिसरॉल, 2 एमएम β-मर्कैप्टोथेनॉल, 500 एमएम इमिडाजोल, पीएच 7.5
बफर एम 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 0.04% डब्ल्यू/वी डीडीएम, 20% वी/वी ग्लिसरॉल, 500 एमएम इमिडाजोल, पीएच 8
बफर एन 50 एमएम केपीआई, 58 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 7.0
बफर ओ 50 एमएम केपीआई, 0.5 एमएम एल-ऑर्निथिन, 10 एमएम ना-एडीपी, 10 एमएम एमजीसीएल2, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 7.0
बफर पी 50 एमएम केपीआई पीएच 7.0, 2 एमएम डीटीटी, एक्स एमएम ग्लूकोज (एक्स बाहरी और आंतरिक माध्यम की परासरण से मेल खाने के लिए विविध है)
बफर क्यू 50 मिमी केपीआई पीएच 7.0, 0.5 एमएम सुक्रोज, 2 एमएम डीटीटी
बफर आर 50 मिमी केपीआई पीएच 7.0, 2 एमएम डीटीटी, 10 एमएम एल-आर्जिनिन, एक्स एमएम ग्लूकोज

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स।

2. प्रोटिओलिपोसोम: शुद्ध झिल्ली प्रोटीन का पूर्ववर्ती लिपिड पुटिकाओं में पुनर्गठन

  1. दिन 1
    1. विकृत लिपिड पुटिकाओं की तैयारी
      1. झिल्ली प्रोटीन की आवश्यकताओं के आधार पर लिपिड संरचना (जैसे, सिंथेटिक फॉस्फोलिपिड, ई।
        नोट: डीओपीई, डीओपीजी और डीओपीसी (25: 25: 50 मोल%) का मिश्रण एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन कुछ प्रोटीनों के लिए स्टेरोल्स या कार्डियोलिपिन की आवश्यकता हो सकती है; खमीर प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के लिए, हम dioleoyl30 के बजाय palmitoyl-oleoyl लिपिड शामिल हैं. एक डोप, डीओपीजी और डीओपीसी (25:25:50 मोल%) मिश्रण एआरसीडी और जीएलपीटी के पुनर्गठन के लिए पर्याप्त है।
      2. वांछित लिपिड (सीएचसीएल3 में घुलनशील) मिलाएं और सीएचसीएल3 को एक रोटरी बाष्पीकरण में वाष्पित करें जब तक कि लिपिड फिल्म न बन जाए। सीएचसीएल3 के समान मात्रा में डायथाइल ईथर जोड़कर लिपिड को धो लें। डायथाइल ईथर को वाष्पित करें और एक सूखी लिपिड फिल्म प्राप्त करें।
      3. जलीय मीडिया (बफर ए) में कुल लिपिड के 20 मिलीग्राम / एमएल लिपिड फिल्म को फिर से निलंबित करें। कुल मात्रा के आधे से शुरू करें और धीरे से हिलाएं; फिर, ध्यान से लिपिड एक साफ ट्यूब या पर्याप्त आकार की बोतल के लिए हस्तांतरण. फ्लास्क में ताजा बफर ए जोड़ें और शेष लिपिड को भंग करने और उन्हें एक नए पोत में स्थानांतरित करने के लिए प्रक्रिया को दोहराएं। एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए अतिरिक्त बफर ए जोड़ें।
      4. एक जांच sonicator का उपयोग resuspended लिपिड sonicate. 6 मिमी के व्यास के साथ एक सोनिकेटर टिप के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 4 माइक्रोन तीव्रता, 70% आयाम, 5 एस पर, 45 एस बंद, 16 चक्र। सोनिकेशन द्वारा ज़्यादा गरम होने से बचने के लिए EtOH युक्त बर्फ के पानी के स्नान में लिपिड को विसर्जित करें।
      5. तरल नाइट्रोजन में सोनिकेटेड नमूना (50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 40 एमएल की मात्रा) फ्लैश-फ्रीज करें, और कमरे के तापमान पर पानी के स्नान में नमूना पिघलाएं। एक बार दोहराएं; फिर, वांछित मात्रा में लिपोसोम को विभाज्य (उदाहरण के लिए, 1.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 1 एमएल या 20 मिलीग्राम कुल लिपिड)।
        स्टॉपिंग पॉइंट: इस बिंदु पर प्रक्रिया को रोका जा सकता है। प्रत्येक विभाज्य को एक बार फिर (तीसरा चक्र) फ्लैश-फ्रीज करें और कुछ महीनों तक तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें। तरल नाइट्रोजन के तेजी से उबलते पर ट्यूब के विस्फोट से बचने के लिए एक सुई के साथ दो बार ट्यूब के ढक्कन छेदने का ख्याल रखना.
  2. दिन 2
    1. पूर्वनिर्मित लिपोसोम में शुद्ध झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन
      1. कमरे के तापमान पर पानी के स्नान में लिपोसोम (20 मिलीग्राम कुल लिपिड) का एक विभाज्य पिघलाएं। इस बीच, पसंद का एक फिल्टर (जैसे, पॉली कार्बोनेट, 400 एनएम के ताकना व्यास) लागू करके एक extruder तैयार; बफर ए के साथ एक्सट्रूडर को पूर्व-संतुलित करें; और पिघले हुए लिपोसोम्स ('दूधिया समाधान") को एक्सट्रूडर में लोड करें और उन्हें फिल्टर के माध्यम से 13x पास करें। एक्सट्रूडेड लिपोसोम्स (अब बड़े यूनिलामेलर पुटिकाओं) को इकट्ठा करें; "अपारदर्शी समाधान") पर्याप्त आकार (जैसे, 15 एमएल) के कांच या प्लास्टिक के बर्तन में। लिपोसोम्स को 2 एमएम डीटीटी के साथ पूरक बफर ए के साथ 4 मिलीग्राम/एमएल तक पतला करें।
      2. 4 मिलीग्राम/एमएल लिपोसोम के 1 एमएल को 1 एमएल पारदर्शी क्यूवेट में स्थानांतरित करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में, 540 एनएम पर प्रारंभिक ऑप्टिकल घनत्व को मापें। मापा नमूना वापस डालो और लिपोसोम के लिए 10% v/v ट्राइटन X-100 के 50 माइक्रोन जोड़ें।
        नोट: 10% ट्राइटन-एक्स 100 के 50 माइक्रोन की अनुमापन मात्रा 5 एमएल की मात्रा में 20 मिलीग्राम लिपिड के लिए उपयुक्त है; ट्राइटन X-100 के अलावा लिपिड ~ 5% पतला हो जाएगा। लिपोसोम की विभिन्न मात्रा के साथ काम करते समय अनुमापन मात्रा को समायोजित करें। स्थिर ऑप्टिकल घनत्व संकेतों के लिए, कमरे के तापमान पर ट्राइटन एक्स -100 के साथ लिपोसोम को अनुमापन करें।
      3. दोहराएँ कदम 2.2.1.2 और ध्यान दें जब एक अधिकतम ऑप्टिकल घनत्व (आरसैट) तक पहुँच गया है. अनुमापन के साथ आगे बढ़ें जब तक कि लगभग 60% आरसाटी का ऑप्टिकल घनत्व (चित्रा 4) तक नहीं पहुंच जाता है। डिटर्जेंट-अस्थिर पुटिकाओं को वापस ग्लास/प्लास्टिक ट्यूब में डालें (अंतिम मात्रा अब लगभग 5.2 एमएल है), नमूना को बर्फ में स्थानांतरित करें, और इसे ठंडा होने दें।
      4. वांछित लिपिड-टू-प्रोटीन अनुपात (डब्ल्यू / डब्ल्यू) तक पहुंचने के लिए अस्थिर लिपोसोम में शुद्ध झिल्ली प्रोटीन जोड़ें। 400:1 से 100:1 w/w के अनुपात का उपयोग करें; चूंकि आर्कडी और जीएलपीटी दोनों में ~ 55 केडीए के आणविक भार होते हैं, इसलिए 400: 1 डब्ल्यू / डब्ल्यू का लिपिड-टू-प्रोटीन अनुपात ~ 30,000 लिपिड प्रति प्रोटीन से मेल खाता है, और ~ आर्कडी और जीएलपीटी के 50 अणु प्रत्येक पुटिकाओं में 400 एनएम के व्यास के साथ।
        नोट: यहां हम 400: 1 डब्ल्यू / डब्ल्यू का उपयोग करते हैं, जो प्रत्येक प्रोटीन के 50 माइक्रोग्राम प्रति 20 मिलीग्राम लिपिड के अनुरूप है।
      5. झिल्ली प्रोटीन को अस्थिर लिपोसोमल झिल्ली में डालने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को नट।
      6. डिटर्जेंट को हटाने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किए गए 200 मिलीग्राम सूखे पॉलीस्टाइनिन मोती जोड़ें। एक और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर nutate.
        नोट: 200 मिलीग्राम सूखे मोतियों की मात्रा 20 मिलीग्राम लिपिड के लिए उपयुक्त है, लेकिन जब एक अलग नमूना आकार का उपयोग किया जाता है तो इसे समायोजित किया जाना चाहिए।
      7. पॉलीस्टाइनिन मोतियों के कुल तीन परिवर्धन के लिए चरण 2.2.1.6 2x दोहराएं। फिर, कोमल नट के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
  3. दिन 3
    1. दोहराएँ कदम 2.2.1.6; हालांकि, इस बार, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नट।
    2. बर्फ पर एक खाली 6.5 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब के ऊपर एक खाली गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ (10 एमएल क्षमता) सुरक्षित करें। स्तंभ में नमूना डालो और (मोती स्तंभ में बनाए रखा जाता है) ultracentrifugation ट्यूब में proteoliposomes इकट्ठा.
    3. 2 एमएम डीटीटी के साथ पूरक बफर ए के 0.5 एमएल के साथ मोती धोएं और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में छानना इकट्ठा करें।
    4. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (337,000 × ग्राम, 30 मिनट, 4 ओसी) द्वारा प्रोटीओलिपोसोम को केंद्रित करें। बफर ए में 200 माइक्रोन (लिपिड / एमएल के 100 मिलीग्राम) की कुल मात्रा में प्रोटीओलिपोसोम को 2 एमएम डीटीटी के साथ पूरक करें; सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पुटिकाओं की सूखी मात्रा ~ 40 से 120 माइक्रोन27 है। वांछित आकार के विभाज्य में विभाजित (उदाहरण के लिए, कुल लिपिड के 6.66 मिलीग्राम के तीन एलिकोट)।
      नोट: विभाज्य आकार मनमाना है लेकिन बाद के चरणों में गोली आकार को प्रभावित करेगा (चरण 3.2.3.1 देखें). स्टॉपिंग पॉइंट: प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है। प्रत्येक विभाज्य को फ्लैश-फ्रीज करें और कुछ हफ्तों तक तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें। तरल नाइट्रोजन के तेजी से उबलते पर ट्यूब के विस्फोट से बचने के लिए एक सुई के साथ ट्यूब ढक्कन दो बार छेद करने के लिए ध्यान रखना.

Figure 4
चित्रा 4: ट्राइटन एक्स -100 के साथ पूर्वनिर्मित लिपोसोम का अनुमापन। 5 मिलीग्राम लिपिड/एमएल पर लिपोसोम्स को 50 एमएम केपीआई (पीएच 7.0) में पॉली कार्बोनेट फिल्टर (400 एनएम) के माध्यम से निकाला जाता है और फिर ट्राइटन एक्स-100 (प्रोटोकॉल चरण 2.2.1.2) के साथ अनुमापन किया जाता है। पुटिकाओं की मैलापन ए540 पर मापा जाता है। तीर ट्राइटन X-100 एकाग्रता को इंगित करता है जिस पर पुटिकाओं को झिल्ली प्रोटीन के सहज सम्मिलन के लिए पर्याप्त रूप से अस्थिर किया जाता है जैसा कि19 में वर्णित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. सबमाइक्रोन-आकार के पुटिकाओं में एटीपी रीसाइक्लिंग और ग्लिसरॉल 3-पी संश्लेषण के लिए एक चयापचय नेटवर्क का एनकैप्सुलेशन

  1. दिन 1
    1. घटकों का मिश्रण
      1. एक मानक एनकैप्सुलेशन के लिए, 200 माइक्रोन (कुल लिपिड के 33.33 मिलीग्राम / एमएल) की अंतिम मात्रा में प्रोटियोलिपोसोम के 66.6 माइक्रोन का उपयोग करें। वांछित एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक प्रत्येक घटक (एंजाइम, कोफ़ेक्टर) की मात्रा की गणना करें, इन घटकों को प्रोटीओलिपोसोम में जोड़ें, और बफर ए(तालिका 2)के साथ मात्रा को 200 माइक्रोन में समायोजित करें।
        नोट: प्रोटीन एकाग्रता प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. हालांकि, देखभाल की जानी चाहिए कि प्रत्येक एंजाइम की कई प्रतियां (>10) प्रति पुटिका औसतन मौजूद हैं, अवांछित स्टोकेस्टिक प्रभाव से बचने के लिए। 1 माइक्रोन > सांद्रता आम तौर पर सुरक्षित होती है; 400 एनएम के व्यास के साथ एक पुटिका में 1 माइक्रोन लगभग 20 प्रतियों (चित्रा 3) से मेल खाती है।
      2. पिपेट बफर ए को खाली 1.5 एमएल ट्यूब में डालें और डीटीटी, ना-एडीपी, एमजीसीएल2, एल-ऑर्निथिन (और पाइरानिन, यदि आंतरिक पीएच माप के लिए आवश्यक हो) जोड़ें। अगला, एंजाइम जोड़ें और धीरे से मिलाएं। पूर्ववर्ती प्रोटीओलिपोसोम के शीर्ष पर समाधान जोड़ें, और कम गति पर संक्षेप में भंवर।
        नोट: मैग्नीशियम फॉस्फेट अवक्षेप के अवांछित गठन से बचने के लिए एमजीसीएल2 से पहले ना-एडीपी जोड़ना महत्वपूर्ण है। चिपचिपा समाधान के उचित मिश्रण के लिए भंवर की आवश्यकता होती है; हालांकि, प्रोटीन को यांत्रिक क्षति से बचने के लिए अवधि और गति को कम करें। PercevalHR और पाइरानिन को सह-समझाया नहीं जा सकता क्योंकि उनका स्पेक्ट्रा ओवरलैप होता है।
    2. आंतरिक परासरण का निर्धारण
      1. चरण 3.1.1.1 में वर्णित 50 माइक्रोन समाधान तैयार करें, लेकिन प्रोटीओलिपोसोम के बिना, और एक ठंड-बिंदु ऑस्मोमीटर के साथ परासरण को मापें।
      2. बफर (50 एमएम केपीआई पीएच 7.0) और नमक (जैसे, NaCl या NaCl) या चीनी की अलग-अलग सांद्रता का उपयोग करके अंशांकन वक्र तैयार करें। ऑस्मोलाइट एकाग्रता निर्धारित करें जो आंतरिक परासरण (बफर एन) से मेल खाती है।
        नोट: झिल्ली पारगम्य घटकों (जैसे, ग्लिसरॉल) का उपयोग आंतरिक परासरण से मेल खाने के लिए नहीं किया जा सकता है। ग्लिसरॉल युक्त बफर (जैसे, बफर ई) में घुलनशील प्रोटीन के लिए, ग्लिसरॉल के बिना एक ही बफर का उपयोग किया जाना चाहिए। आइसो-आसमाटिक बाहरी बफर की तैयारी के लिए चुना गया ऑस्मोलाइट झिल्ली-अभेद्य होना चाहिए और चयापचय नेटवर्क में हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए।
    3. फ्रीज-विगलन
      1. फ्लैश-फ्रीज (तरल नाइट्रोजन में) घुलनशील घटकों के साथ प्रोटीओलिपोसोम, और लगभग 10 डिग्री सेल्सियस पर पानी-बर्फ स्नान में पिघलना।
      2. कुल 5x के लिए चरण 3.1.3.1 दोहराएं।
        स्टॉपिंग पॉइंट: प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है। अंतिम विगलन चरण छोड़ें, और जमे हुए नमूने को 1-3 दिनों के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत करें। तरल नाइट्रोजन के तेजी से उबलने पर ट्यूब के विस्फोट से बचने के लिए एक सुई के साथ ट्यूब के ढक्कन 2x छेदने के लिए ध्यान रखना. लिपिड ऑक्सीकरण को कम करने के लिए तरल नाइट्रोजन में भंडारण -80 डिग्री सेल्सियस से अधिक पसंद किया जाता है।
  2. दिन 2
    1. बाहर निकालना
      नोट: सभी एक्सट्रूज़न चरण कमरे के तापमान पर किए जाते हैं, क्योंकि गैसटाइट सीरिंज अन्यथा रिसाव करेंगे।
      1. पसंद का एक फिल्टर (जैसे, पॉली कार्बोनेट, 400 एनएम का ताकना व्यास) लागू करके एक एक्सट्रूडर तैयार करें। पुटिकाओं के एनकैप्सुलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही बफर और मेटाबोलाइट्स युक्त समाधान के साथ एक्सट्रूडर को धो लें (जैसे, बफर ओ प्लस 0.1 एमएम पाइरानीन)।
        नोट: पाइरानिन के साथ प्रोटीओलिपोसोम की लोडिंग के लिए एक समर्पित एक्सट्रूडर का उपयोग करें क्योंकि डाई एक्सट्रूडर सतह से चिपक जाती है और बाद के नमूनों में संदूषण का कारण बन सकती है।
      2. एक्सट्रूडर में एनकैप्सुलेशन मिश्रण लोड करें, और इसे फिल्टर 13x के माध्यम से पास करें। एक 1.5 एमएल ट्यूब में extruded समाधान ले लीजिए.
    2. आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (वैकल्पिक)
      नोट: यह कदम आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा पाइरानिन जैसे रंगों जैसे बाहरी अणुओं को हटाने के लिए किया जाता है। यदि सिस्टम में रंजक मौजूद नहीं हैं, और अन्य घटक कम सांद्रता में हस्तक्षेप नहीं कर रहे हैं (ध्यान दें कि पुटिकाओं को बाद में अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा भी धोया जाता है), तो चरण 3.2.2। छोड़ा जा सकता है।
      1. सेफैडेक्स जी -75 राल को फिर से हाइड्रेट करें और इसे एक ग्लास कॉलम (22 सेमी लंबा, 1.5 सेमी चौड़ा) में डालें। बाहरी बफर (जैसे, बफर एन) की अधिकता के साथ राल को संतुलित करें।
      2. पूर्व निर्धारित आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर चरण 3.2.1.2 से निकाले गए प्रोटीओलिपोसोम लोड करें और बाहरी बफर का गुरुत्वाकर्षण प्रवाह लागू करें। शून्य मात्रा (लगभग 7 एमएल) त्यागें; फिर, दस 1 एमएल विभाज्य इकट्ठा. एक यूवी दीपक के लिए कम जोखिम से प्रोटीओलिपोसोम युक्त एलिकोट की कल्पना करें। अधिकांश प्रोटीओलिपोसोम (2-4 एमएल) वाले अंशों को पूल करें।
    3. धुलाई और निलंबन
      1. extruded प्रोटीओलिपोसोम को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा धोएं। बफर एन के 5.8 एमएल के साथ एक 6.5 एमएल ultracentrifugation ट्यूब भरें, और शीर्ष पर extruded नमूना लागू. यदि आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का प्रदर्शन किया गया था, तो ट्यूब को पूल किए गए क्षालन नमूनों (2-4 एमएल) के साथ भरें और बफर एन को 6 एमएल की अंतिम मात्रा में जोड़ें।
      2. 337,000 × ग्राम, 30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और अच्छी तरह से एक धूल मुक्त ऊतक के साथ ultracentrifugation ट्यूब सूखी है, जबकि गोली को छूने के लिए नहीं ध्यान दे. बफर एन (200 माइक्रोन) की एक छोटी मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें। जब गोली पूरी तरह से resuspended है, बफर एन के साथ 6 एमएल अप करने के लिए ट्यूब भरें.
        नोट: गोली को निलंबित करने में समय लगेगा और सावधानी से किया जाना चाहिए।
      3. कुल तीन washes के लिए चरण 3.2.3.1-3.2.3.2 2x दोहराएं, जब तक कि आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी नहीं की जाती है (जिस स्थिति में एक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण पर्याप्त होता है)। अंततः, बफर एन की उचित मात्रा जोड़कर एक वांछित एकाग्रता (जैसे, 5.55 मिलीग्राम /
        स्टॉपिंग पॉइंट: प्रोटीओलिपोसोम को तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या कम से कम 48 घंटे के लिए 4 डिग्रीसेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। नमूना आकार के आधार पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूबों का आकार चुना जाना चाहिए। कुल लिपिड के 6.66 मिलीग्राम की एक गोली के लिए, एक 6.5 एमएल ट्यूब उपयुक्त है. 3 x 6 एमएल बफर के लिए प्रोटिओलिपोसोम के 200 माइक्रोन (कुल लिपिड / एमएल के 33.33 मिलीग्राम; सूखी गोली मात्रा ~ 40 माइक्रोन)28 धोने से प्रत्येक धोने के चरण के लिए 100 के कारक द्वारा बाहरी घटकों को पतला करता है। यदि विभिन्न आकारों के ट्यूबों का उपयोग किया जाता है, तो तदनुसार वॉश की संख्या को समायोजित करना वांछनीय है।
  3. दिन 3
    1. प्रतिदीप्ति द्वारा एटीपी संश्लेषण का पता लगाना
      1. 3 x 5 मिमी की खिड़की और 100 माइक्रोन की न्यूनतम आंतरिक मात्रा के साथ एक काले क्वार्ट्ज क्यूवेट में 120 माइक्रोन (तालिका 3) की अंतिम मात्रा में प्रतिक्रिया घटकों को मिलाएं।
        नोट: इलेक्ट्रोकेमिकल आयन ग्रेडिएंट को नष्ट करने के लिए आयनोफोर्स को जोड़ा जा सकता है। वैलिनोमाइसिन और नाइजेरिसिन (प्रत्येक 1 माइक्रोन) का मिश्रण प्रभावी रूप से किसी भी प्रोटॉन और पोटेशियम ग्रेडिएंट को नष्ट कर देता है।
      2. 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट फ्लोरोमीटर में नमूना प्रीवार्म करें और PercevalHR (उत्तेजना 400-520 एनएम, बैंडविड्थ 5 एनएम; उत्सर्जन 550 एनएम, बैंडविड्थ 5 एनएम) के उत्तेजना स्पेक्ट्रा प्राप्त करें। एक बार जांच संकेत स्थिर है, एल arginine (5-10 मिमी), और ग्लिसरॉल (400 माइक्रोन) की अधिकता के अलावा जब एटीपी के रीसाइक्लिंग ग्लिसरॉल 3 फॉस्फेट के संश्लेषण के लिए युग्मित है द्वारा चयापचय नेटवर्क शुरू. समय के साथ प्रतिक्रिया का पालन करें।
    2. डेटा विश्लेषण
      1. अनुपात F500/F430 को समय के फलन के रूप में प्लॉट करें, जो ATP/ADP अनुपात का गुणात्मक संकेतक है। एटीपी गठन का एक और अधिक मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए, प्रोटिओलिपोसोम में एक अंशांकन वक्र का निर्माण या एक पूरक दृष्टिकोण (जैसे, chemiluminescence28 द्वारा एटीपी मात्रा का ठहराव) का उपयोग करें.
घटक अंतिम एकाग्रता
बफर ए 50 मिमी केपीआई पीएच 7.0
डीटीटी 2 मिमी
ना-एडीपी 10 मिमी
एमजीसीएल2 10 मिमी
एल-ऑर्निथिन 0.5 मिमी
फ्लोरोसेंट जांच (PercevalHR या pyranine) 5.8 माइक्रोन या 0.1 मिमी, क्रमशः
ArcA (Arginine deiminase) 1 माइक्रोन
ArcB (ऑर्निथिन कार्बामॉयलट्रांसफेरेज़) 2 माइक्रोन
ArcC1 (कार्बामेट किनेज) 5 माइक्रोन
GlpK (ग्लिसरॉल किनेज) 1.6 माइक्रोन
प्रोटीओलिपोसोम 33.33 mg/mL कुल लिपिड

तालिका 2: एनकैप्सुलेशन घटक। घटकों को जोड़ के क्रम में सूचीबद्ध किया गया है। घुलनशील प्रोटीन बफर ई में हैं; अन्य सभी घटक (एमजीसीएल2 को छोड़कर, विआयनीकृत पानी में) बफर ए में हैं।

घटक अंतिम एकाग्रता
बफर K 50 मिमी केपीआई पीएच 7.0, 58 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 7.0
प्रोटीओलिपोसोम (5.55 मिलीग्राम/एमएल लिपिड) 2.7 मिलीग्राम / एमएल लिपिड
आयनोफोरस (वैलिनोमाइसिन, नाइजेरिसिन) 1 माइक्रोन प्रत्येक

तालिका 3: प्रायोगिक स्थितियां। घटकों को जोड़ के क्रम में सूचीबद्ध किया गया है। प्रोटीओलिपोसोम बफर एन में हैं, डीएमएसओ या ईटीओएच में आयनोफोर।

4. माइक्रोमीटर के आकार के पुटिकाओं के लिए एक चयापचय नेटवर्क को बढ़ाना

  1. दिन 1
    1. माइक्रोफ्लुइडिक चिप तैयारी
      नोट: यह प्रयोग रॉबिन्सन एट अल34द्वारा विकसित एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करता है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के अन्य डिजाइन 35,36,37 उपलब्ध हैं और आसानी से इस प्रोटोकॉल में लागू किया जा सकता है।
      1. नीचे से एक तिहाई 200 माइक्रोन पिपेट टिप काटें और टिप के निचले हिस्से को एक प्रीमियर माइक्रोफ्लुइडिक ट्रैपिंग डिवाइस में डालें।
      2. चिप के इनलेट जलाशय में, β-कैसिइन समाधान (2 मिलीग्राम/एमएल; चरण 1.5 देखें) के 400 माइक्रोन जोड़ें, इस चरण में हवा की शुरूआत को रोकने के लिए देखभाल करें। एक 96 अच्छी तरह से थाली बाल्टी रखें और एक टेबलटॉप शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र में एक प्रयोगशाला ऊतक जोड़ें. माइक्रोफ्लुइडिक चिप के निष्क्रियता की अनुमति देने के लिए 900 × ग्राम पर 6 मिन के लिए ऊतक और अपकेंद्रित्र के शीर्ष पर चिप रखें। सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के बाद, तरल स्तर इनलेट जलाशय और माइक्रोफ्लुइडिक चिप के आउटलेट टिप पर बराबर होना चाहिए; चिप के रिसाव की जाँच करें। कम से कम 30 मिनट के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप में β-कैसिइन समाधान को इनक्यूबेट करें।
      3. हवा शुरू किए बिना अधिकांश निष्क्रियता समाधान निकालें और वाशिंग बफर (बफर पी) के 400 माइक्रोन जोड़ें। चिप को 96-अच्छी तरह से प्लेट बाल्टी पर रखें और 6 मिन के लिए 900 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र रखें। चिप को वाशिंग सॉल्यूशन में तब तक छोड़ दें जब तक कि उपयोग न हो जाए (अधिकतम 4h के लिए)।
  2. प्रोटियो-जीयूवी बनाने के लिए जेल की तैयारी
    नोट: निम्नलिखित विवरण लिया गया है और25,38 से अनुकूलित किया गया है।
    1. माइक्रोवेव में घोल को गर्म करके विआयनीकृत पानी में कम-गेलिंग तापमान (एलजीटी) के 0.5% (w/w) को घोलें; सुनिश्चित करें कि अगारोज पूरी तरह से भंग हो गया है और समाधान को उबालने से बचें। आगे उपयोग तक 50 डिग्री सेल्सियस पर agarose रखें.
      नोट: भंग agarose कई हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है. अगारोज का फिर से उपयोग करने के लिए, बस माइक्रोवेव का उपयोग करके जेल को पिघलाएं।
    2. दो उद्देश्य स्लाइड लें और स्लाइड्स पर स्पेसर की रूपरेखा बनाएं। प्लाज्मा सफाई द्वारा स्लाइड हाइड्रोफिलिक बनाओ, 1 मिनट के लिए उच्च ऑक्सीजन प्लाज्मा का उपयोग कर.
    3. स्लाइड के शीर्ष पर एलजीटी एगरोज जोड़ें जब तक कि यह पूरी तरह से अगारोज (~ 500 माइक्रोन) के साथ कवर न हो जाए; फिर, 90 ° के कोण पर स्लाइड झुकाव और एक ऊतक पर अतिरिक्त agarose नाली. 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए स्लाइड छोड़ दें।
    4. तरल नाइट्रोजन (धारा 3) में संग्रहीत प्रोटीओलिपोसोम लें और बर्फ पर पिघलें। बफर क्यू का उपयोग करके पुटिकाओं को 5 मिलीग्राम /
      नोट: धारा 3 में तैयार प्रोटीओलिपोसोम में घुलनशील प्रोटीन नहीं होते हैं और तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत होने पर अग्रिम में अच्छी तरह से तैयार किया जा सकता है। प्रोटीओजीयूवी के साथ काम करते समय, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के क्लॉगिंग को रोकने के लिए हमेशा काम करने वाले समाधानों को फ़िल्टर करना सुनिश्चित करें।
    5. एक 1 मिमी जांच के साथ एक हाथ में जांच sonicator का उपयोग प्रोटीन liposomes सोनिकेट. 70% आयाम पर 0.5 एस और 0.5 एस बंद के 10 चक्रों के लिए सोनिकेट। पुटिकाओं को रखें, इसके बाद प्रोटियोएसयूवी के रूप में संदर्भित, 30 एस के लिए बर्फ पर, और सोनिकेशन प्रक्रिया को 5x दोहराएं।
    6. प्रोटियो-एसयूवी निलंबन के साथ एक 100 माइक्रोन सिरिंज (एक हैंडहेल्ड एलसीपी डिस्पेंसर में) भरें। पहले से तैयार अगारोज जेल पर प्रोटियो-एसयूवी की 0.5 माइक्रोन बूंदों को जमा करें; सावधान रहें कि अगारोज परत को परेशान न करें और बूंदों को फ्यूज करने से रोकने के लिए पर्याप्त दूरी बनाए रखें।
      नोट हाथ से आयोजित एलसीपी डिस्पेंसर का उपयोग करने से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से छोटी बूंद जमाव की अनुमति मिलती है, लेकिन वैकल्पिक पाइपिंग सिस्टम का भी उपयोग किया जा सकता है। एक ग्लास केशिका के साथ स्पॉटिंग कम उपयुक्त है क्योंकि यह सूखे अगारोज जेल को परेशान करता है।
    7. लिपिड ऑक्सीकरण की संभावना को कम करने के लिए संपीड़ित हवा के बजाय नाइट्रोजन प्रवाह का उपयोग करके ~ 10 मिनट में एसयूवी बूंदों को सूखें।
    8. बफर ए में 1.25x केंद्रित बफर ओ (तालिका 4) के 1 एमएल तैयार करें और 0.2 माइक्रोन सेलूलोज़ एसीटेट फिल्टर से गुजरें। 1.25x केंद्रित समाधान के 800 माइक्रोन लें और घुलनशील एंजाइमों और जांच को एक एकाग्रता में जोड़ें जैसा कि तालिका 4में दर्शाया गया है। अंतिम मात्रा 1 एमएल बनाने के लिए फ़िल्टर्ड विआयनीकृत पानी का उपयोग करें।
    9. प्रोटीन और ग्लिसरॉल के अपवाद के साथ, तालिका 4 के सभी घटकों वाले सूजन समाधान के 100 माइक्रोन तैयार करें। एक 3 बिंदु अंशांकित ठंड बिंदु ऑस्मोमीटर का उपयोग कर सूजन समाधान के परासरण को मापें.
      नोट: इस समाधान की परासरण को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए प्रोटीन और ग्लिसरॉल के बिना सूजन समाधान के 100 माइक्रोन तैयार करें। ग्लिसरॉल, जो प्रोटीन समाधान में मौजूद है, परासरण को प्रभावित करता है, लेकिन, जीयूवी में, ग्लिसरॉल तेजी से झिल्ली में फैलता है और केवल क्षणिक आसमाटिक अंतर की ओर जाता है।
    10. बीच में 1.5 या 3.0 मिमी मोटी टेफ्लॉन स्पेसर के साथ जेल और सूखे एसयूवी युक्त दो उद्देश्य चश्मे का एक सैंडविच बनाकर जीयूवी सूजन कक्ष को इकट्ठा करें। फिर, एक सिरिंज और सुई का उपयोग पक्ष में छोटे छेद के माध्यम से कक्ष में सूजन समाधान जोड़ें.
      नोट: सूजन समाधान की मात्रा को स्पेसर को 1.5 से 3.0 मिमी तक बदलकर समायोजित किया जा सकता है।
  3. पुटिकाओं की सूजन और जीयूवी की कटाई
    1. कम से कम 30 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर कक्ष डाल कर पुटिकाओं की सूजन की अनुमति दें.
      नोट: पुटिकाओं की सूजन प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया जा सकता है, (उदाहरण के लिए, एक टेबलटॉप चरण विपरीत माइक्रोस्कोप या एक वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप) यदि प्रोटीन या लिपिड फ्लोरोसेंटली लेबल हैं।
    2. एक ठोस सतह (जैसे, प्रयोगशाला बेंच) पर कक्ष दोहन द्वारा कोमल शारीरिक आंदोलन लागू करके जेल से GUVs फसल; मात्रा का एक तिहाई बाहर ले लो और जिसके परिणामस्वरूप हवा बुलबुला का उपयोग धीरे शेष तरल के लिए गति प्रेरित जिससे जेल से GUVs अलग हो.
    3. जबकि जीयूवी सूजन कर रहे हैं, बफर पी तैयार करें और ग्लूकोज की एकाग्रता को समायोजित करके सूजन समाधान के साथ परासरण का मिलान करें। एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से बफर फ़िल्टर.
      नोट: सामान्य तौर पर, धुलाई और सब्सट्रेट समाधान को ± 5 मॉमोल/किग्रा के भीतर रखा जाना चाहिए। चिप से गुजरने वाला कोई भी घोल बहुत साफ होना चाहिए क्योंकि दूषित पदार्थ चैनलों को रोक सकते हैं। हर बार ताजा बफ़र्स बनाएं या -20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार बफ़र्स स्टोर करें और उपयोग करने से पहले फ़िल्टर करें।
  4. माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए GUVs का फँसाना
    1. माइक्रोस्कोप के नमूना चरण पर निष्क्रिय माइक्रोफ्लुइडिक चिप माउंट करें। संभावित दोषों की जाँच करें (जैसे, लीक, फंसी हुई हवा, भरा हुआ चैनल)।
      नोट: चिप की जाँच करने से पहले अच्छी तरह से किया जा सकता है ताकि यदि आवश्यक हो तो एक नई चिप तैयार की जा सके।
    2. जलाशय के आउटलेट के लिए एक तुला सुई का उपयोग कर टयूबिंग कनेक्ट करें और एक 1 एमएल सिरिंज के लिए दूसरे छोर कनेक्ट. एक पंप के लिए सिरिंज माउंट और 10 माइक्रोन / मिनट की एक अधिकतम करने के लिए प्रवाह दर सेट.
    3. जलाशय से धोने बफर निकालें (चरण 4.1.1.3) और ताजा माध्यम (बफर पी) के साथ बदलें। 1-10 माइक्रोन/मिनट पर सिरिंज के माध्यम से संक्रमित करके चिप के माध्यम से बफर का प्रवाह शुरू करें। ऑस्मोटिक रूप से संतुलित वाशिंग बफर (बफर पी) के कम से कम 80 माइक्रोन के साथ धोएं।
    4. जलाशय से अतिरिक्त वॉश बफर निकालें और जलाशय में (प्रोटियो) जीयूवी जोड़ें। जीयूवी को चिप के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति देने के लिए प्रवाह दर को 0.1- 1 माइक्रोन/मिनट तक समायोजित करें। समय के साथ चिप की निगरानी करें जब तक कि चिप में पर्याप्त GUV फंस न जाएं।
      नोट: फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल (पीजी), फॉस्फेटिडिल सेरीन (पीएस), या फॉस्फेटिडिक एसिड (पीए) या फॉस्फेटिडिलथेनॉलमाइन (पीई) जैसे गैर-बाइलेयर-फॉर्मिंग लिपिड जैसे चार्ज लिपिड की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (>20 मोल%) वाले पुटिकाओं को फटने से रोकने के लिए चिप के माध्यम से कम प्रवाह दर पर पेश किया जाता है। Vesicles शुद्ध phosphatidylcholine से बना (पीसी) और अधिक स्थिर हो जाते हैं.
    5. अतिरिक्त जीयूवी समाधान निकालें और बाहरी माध्यम का आदान-प्रदान करने के लिए 0.1-1 माइक्रोन/मिनट के निरंतर प्रवाह का उपयोग करके वाशिंग बफर पी जोड़ें और गैर-एनकैप्सुलेटेड यौगिकों को हटाने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए फंसे जीयूवी को धोएं और फ्लोरोफोर को समझाया जाता है जब पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम होती है। समय के साथ पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की निगरानी करें; यदि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम नहीं होती है, तो चिप अवरुद्ध हो सकती है।
    6. पुटिकाओं की पर्याप्त मात्रा के साथ जाल का स्थानीयकरण करें और उनकी स्थिति को बचाएं। माइक्रोस्कोप (जैसे, लेजर तीव्रता, लाभ, तरंग दैर्ध्य) पर सेटिंग्स लागू करें और एक समय श्रृंखला प्रयोग शुरू करें।
    7. जलाशय में ऑस्मोटिक रूप से संतुलित सब्सट्रेट समाधान (बफर आर) जोड़ें और 0.5 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर शुरू करें।

बफर एल घटक
घटक 1.25 x एकाग्रता काम एकाग्रता
बफर ए 62.5 मिमी KPi पीएच 7.0 50 मिमी केपीआई पीएच 7.0
इक्षु शर्करा 125 मिमी 100 मिमी
डीटीटी 2.5 मिमी 2 मिमी
ना-एडीपी 12.5 मिमी 10 मिमी
एमजीसीएल2 12.5 मिमी 10 मिमी
एल-ऑर्निथिन 0.625 मिमी 0.5 मिमी
एनकैप्सुलेशन घटक
पाइरानिन या PercevalHR 1 मिमी या 20 माइक्रोन
ArcA (Arginine deiminase) 1 माइक्रोन
ArcB (ऑर्निथिन कार्बामॉयलट्रांसफेरेज़) 2 माइक्रोन
ArcC1 (कार्बामेट किनेज) 5 माइक्रोन

तालिका 4: बफर ओ और एनकैप्सुलेशन घटक। घटकों को जोड़ के क्रम में सूचीबद्ध किया गया है। सभी घटक (एमजीसीएल2 को छोड़कर, विआयनीकृत पानी में) बफर ए में हैं। सभी पानी में घुलनशील प्रोटीन बफर ई में हैं।

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Representative Results

लिपोसोम्स में घुलनशील झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए पूर्वनिर्मित पुटिकाओं की अस्थिरता की आवश्यकता होती है। ट्राइटन एक्स-100 की कम मात्रा के अलावा शुरू में पुटिकाओं की सूजन (चित्रा 4) द्वारा प्रकाश प्रकीर्णन में वृद्धि के कारण 540 एनएम (ए540) पर अवशोषण में वृद्धि होती है। अधिकतम ए540 मान वह बिंदु है जहां लिपोसोम डिटर्जेंट (आरसैट) से संतृप्त होते हैं, जिसके बाद ट्राइटन एक्स -100 के किसी भी आगे के जोड़ के परिणामस्वरूप पुटिकाओं का आंशिक घुलनशीलता होगा। आरसोल पर, लिपोसोम पूरी तरह से घुलनशील होते हैं (चित्र 4)। झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए, हम आम तौर पर आरसैट (तीर द्वारा इंगित) से परे 60% तक अस्थिर पुटिकाओं का उपयोग करते हैं।

पुनर्गठित झिल्ली प्रोटीन ArcD का उपयोग L-arginine को पुटिकाओं से बाहर और L-ornithine में परिवहन के लिए किया जाता है और ADP और अकार्बनिक फॉस्फेट से ATP को रीसायकल करने के लिए Encapsulated एंजाइम ArcA, ArcB और ArcC के साथ उपयोग किया जाता है। जीएलपीटी एक ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट / फॉस्फेट एंटीपोर्टर है जो एल-आर्जिनिन ब्रेकडाउन द्वारा उत्पादित ग्लिसरॉल प्लस एटीपी से ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट के संश्लेषण (और उत्सर्जन) के लिए जीएलपीके के साथ मिलकर आवश्यक है। प्रोटियोलिपोसोम के लिए टी = 0 पर 5 एमएम एल-आर्जिनिन के अलावा 500 और 430 एनएम उत्तेजना39 पर पर्सेवलएचआर प्रतिदीप्ति के अनुपात में भारी वृद्धि होती है, जो पुटिकाओं के अंदर एटीपी/एडीपी अनुपात को दर्शाता है (चित्र 5)। ग्लिसरॉल के अलावा, एटीपी ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट के संश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एटीपी/एडीपी अनुपात28 कम हो जाता है। एल-आर्जिनिन के टूटने से पीएच परिवर्तन भी होता है, जिसे पाइरानिन या पीएचलुओरिन27 का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है।

Figure 5
चित्रा 5: एल-आर्जिनिन ब्रेकडाउन मार्ग द्वारा एटीपी का पुनर्चक्रण। एमएल के 2.7 मिलीग्राम पर एलयूवी को एक क्यूवेट में रखा जाता है और 500 एनएम और 430 एनएम पर प्रतिदीप्ति का अनुपात दर्ज किया जाता है। एल-आर्जिनिन के 5 मिमी को टी = 0 पर जोड़ा जाता है। F500/F430 अनुपात पुटिकाओं के अंदर ATP/ADP अनुपात का एक माप है। संक्षिप्तीकरण: LUVs = बड़े-यूनिलामेलर पुटिकाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एटीपी-उत्पादक एलयूवी का उपयोग जीयूवी बनाने के लिए भी किया जा सकता है। एलजीटी एगरोज जेल पर सूखे प्रोटियो-एलयूवी के पुनर्जलीकरण के परिणामस्वरूप माइक्रोमीटर-आकार के पुटिकाओं का निर्माण होता है (चित्र 6)। सूखे एलयूवी स्पॉट के भीतर प्रोटियो-जीयूवी का गठन लिपिड की स्थानीय एकाग्रता और निर्जलीकरण की डिग्री पर निर्भर करता है। कुछ क्षेत्रों में जीयूवी के बड़े पैच होते हैं, जबकि अन्य स्थानों पर एक ही बूंद में, कोई या कुछ जीयूवी नहीं बन सकते हैं। एलजीटी एगरोज़-असिस्टेड सूजन के माध्यम से जीयूवी के गठन के परिणामस्वरूप जीयूवी आकारों की एक श्रृंखला होती है, आमतौर पर कुछ माइक्रोमीटर से 50 माइक्रोन से अधिक तक।

Figure 6
चित्रा 6: जेल-सहायता प्राप्त सूजन द्वारा गठित प्रोटीओजीयूवी की डीआईसी छवियां। स्केल बार = 25 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: डीआईसी = अंतर हस्तक्षेप विपरीत; GUVs = विशाल-unilammellar पुटिकाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जीयूवी काटा जाता है और एक β-कैसिइन निष्क्रिय पीडीएमएस आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस(चित्रा 7)में फंस जाता है। डिवाइस को इस तरह से डिज़ाइन किया गया है कि एक ही प्रयोग के भीतर कई पुटिकाओं को फंसाया और विश्लेषण किया जा सकता है, और डिवाइस का उपयोग बाहरी वातावरण (प्रवाह दर, बफर संरचना, आदि) को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है। 34. यहां तक कि जब प्रोटियो-जीयूवी की उपज कम होती है, तब भी माइक्रोफ्लुइडिक चिप के माध्यम से जीयूवी का निरंतर प्रवाह कई पुटिकाओं को एकत्र करने में सक्षम बनाता है। एक बार पर्याप्त जीयूवी फंस जाने के बाद, सिस्टम को घुलनशील प्रोटीन, छोटे अणुओं और फ्लोरोसेंट जांच जैसे बाहरी घटकों को हटाने के लिए एक ऑस्मोटिक रूप से संतुलित बफर से धोया जाता है। वाशिंग बफर को तब 50 एमएम केपीआई (पीएच 7.0), ग्लूकोज की अलग-अलग मात्रा (ऑस्मोलैलिटी को समायोजित करने के लिए), और 10 एमएम एल-आर्जिनिन जैसे सब्सट्रेट युक्त समान ऑस्मोलैलिटी के सब्सट्रेट समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप के कई जाल पर एक समय श्रृंखला प्रयोग किया जाता है और छवियों को हर 90 एस (405 एनएम और 488 एनएम उत्तेजना जब PercevalHR का उपयोग किया जाता है) लिया जाता है। इसके अलावा, प्रत्येक समय बिंदु पर एक ब्राइटफील्ड छवि ली जाती है। 488 और 405 एनएम पर उत्तेजना के बाद उत्सर्जन तीव्रता का अनुपात पुटिकाओं में एडीपी/एटीपी अनुपात का एक उपाय है।

Figure 7
चित्रा 7: माइक्रोफ्लुइडिक चिप के साथ पुटिकाओं को फँसाना। (ए) पुटिकाओं को फँसाना, बाहरी वातावरण और प्रवाह दर को नियंत्रित करने की क्षमता के साथ। (बी) प्रोटीओजीयूवी एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में फंस गए और 405 एनएम लेजर (हरा) और 488 लेजर (लाल) के साथ उत्साहित हुए। दोनों चैनलों के लिए उत्सर्जन >500 एनएम पर मापा जाता है। ब्राइटफील्ड छवि प्रतिदीप्ति के बिना पुटिकाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है। स्केल बार = 25 माइक्रोन. संक्षिप्त: GUVs = विशाल-यूनिलामेलर पुटिकाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम उप-माइक्रोमीटर आकार लिपिड पुटिकाओं (प्रोटीओएलयूवी) युक्त (झिल्ली) प्रोटीन के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, और विशाल-यूनिलामेलर पुटिकाओं (प्रोटीओजीयूवी) में प्रोटीओएलयूवी के रूपांतरण। प्रोटोकॉल अन्य झिल्ली प्रोटीन 13,19,30,40 के पुनर्गठन और एल-आर्जिनिन टूटने और ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट संश्लेषण मार्गों के अलावा अन्य चयापचय नेटवर्क के एनकैप्सुलेशन के लिए लागू होना चाहिए।

लिपोसोम्स में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन आम तौर पर लिपिड झिल्ली के भीतर प्रोटीन का एक यादृच्छिक अभिविन्यास पैदा करता है। आर्कडी और जीएलपीटी के लिए, अभिविन्यास कोई फर्क नहीं पड़ता, क्योंकि प्रोटीन द्विदिश रूप से संचालित होते हैं और विलेय कुल विद्युत रासायनिक क्षमता के संकेत के आधार पर चलते हैं। एक दिशा में कार्य करने वाले प्रोटीन के लिए, आधे अणु गतिविधि के लिए उपलब्ध नहीं होंगे जब उनका अभिविन्यास 50/50 होगा।

पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से पुटिकाओं का एक्सट्रूज़न आकार वितरण को कम करता है, और पुटिका फिल्टर के छिद्र आकार के छोटे से अधिक सजातीय हो जाते हैं। हालांकि, छोटे पुटिका एक छोटी मात्रा होने की कीमत पर आते हैं और इस प्रकार, प्रति पुटिका प्रोटीन (एंजाइम, झिल्ली प्रोटीन) की बहुत कम संख्या होती है। एक या एक से अधिक घटकों के गायब होने वाले एलयूवी के अंश को कम करने के लिए, प्रोटीन की एकाग्रता को समायोजित किया जा सकता है जैसा कि चित्रा 3ए, बी में दिखाया गया है, लेकिन बहुत छोटे पुटिकाओं के साथ स्टोकेस्टिक प्रभाव अपरिहार्य हैं।

जेल-असिस्टेड सूजन विधि सूखे अगारोज सतह पर सोनिकेटेड पुटिकाओं (एसयूवी) के जमाव पर निर्भर करती है। सुखाने की प्रक्रिया के दौरान, पुटिकाओं का एक एकाग्रता ढाल बनता है और स्थान की परिधि में लिपिड एकाग्रता सबसे अधिक होती है। यह कॉफी दागप्रभाव 41,42 के रूप में जाना जाता एक घटना के कारण है. नतीजतन, स्पॉट के भीतर केवल एक छोटे से क्षेत्र में जीयूवी गठन के लिए उपयुक्त लिपिड की एकाग्रता होती है। परिपत्र असमान-केंद्रित लिपिड स्पॉट के परिणामस्वरूप बड़े अप्रयुक्त क्षेत्र होते हैं जो पुटिका संलयन के लिए उपलब्ध नहीं होते हैं; इसलिए, इस दृष्टिकोण में जीयूवी गठन की दक्षता कम हो जाती है। जीयूवी की उपज बढ़ाने के लिए, एक को एक समान लिपिड जमाव का लक्ष्य रखना चाहिए, जिसे स्पिन कोटिंग42 या कॉफी दाग प्रभाव41 का लाभ उठाकर पूरा किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल पर आगे नोट्स:

ध्यान रखा जाना चाहिए कि स्टोकेस्टिक प्रभाव से बचने के लिए कई झिल्ली प्रोटीन (>10) प्रति पुटिका औसतन पुनर्गठित किए जाते हैं। इस प्रकार, लिपिड-टू-प्रोटीन अनुपात से अधिक 400: 1 डब्ल्यू / डब्ल्यू से बचें। अधिकांश प्रोटीनों के लिए एक यादृच्छिक अभिविन्यास माना जाता है।

आदर्श रूप से, कुल झिल्ली प्रोटीन की मात्रा जितना संभव हो उतना छोटा है और वैसे भी लिपोसोम मात्रा के 10-20% से अधिक नहीं है। बड़ी मात्रा में जोड़ने से अधिक डिटर्जेंट पेश किया जाएगा और अधिकांश पूर्वनिर्मित लिपोसोम लाइज़ हो सकते हैं, जो पुनर्गठन दक्षता पर नकारात्मक प्रभाव डाल सकते हैं।

एनकैप्सुलेशन के दौरान घटकों के कमजोर पड़ने से बचने के लिए उचित समाधान के साथ एक्सट्रूडर का पूर्व-संतुलन महत्वपूर्ण है। आदर्श रूप से, प्रीइक्विलिब्रेशन समाधान में घुलनशील एंजाइम भी शामिल होने चाहिए, लेकिन एक्सट्रूडर के पूर्व-संतुलन के लिए आवश्यक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा के कारण एंजाइम सहित बहुत महंगा हो सकता है। इसलिए, हम आम तौर पर इन घटकों को छोड़ देते हैं और एंजाइमों के 5% कमजोर पड़ने को स्वीकार करते हैं।

आयनोफोर्स को प्रोटिओलिपोसोम युक्त मिश्रण में जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि अणु अत्यधिक हाइड्रोफोबिक होते हैं और यदि पुटिका मौजूद नहीं हैं तो सतहों पर सोख सकते हैं। देखभाल की जानी चाहिए कि जोड़ा विलायक की मात्रा कम है (कुल प्रतिक्रिया मात्रा का <1%). नियंत्रण यह सत्यापित करने के लिए किया जाता है कि सॉल्वैंट्स पुटिकाओं में चयापचय नेटवर्क को प्रभावित नहीं करते हैं। लगभग 1 माइक्रोन की आयनोफोर सांद्रता आमतौर पर ~ 3 मिलीग्राम / एमएल की कुल लिपिड सांद्रता के लिए सुरक्षित होती है।

बूंदों को अच्छी तरह से सूखने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यदि बूंदें पर्याप्त सूखी नहीं हैं, तो जीयूवी गठन कम कुशल है क्योंकि लिपिड लिपिड समुच्चय बनाएंगे और सूजन समाधान जोड़े जाने पर एमएलवी बन सकते हैं।

ग्लूकोज का उपयोग बाहरी से आंतरिक माध्यम के परासरण से मेल खाने के लिए किया जाता है; उत्तरार्द्ध में पुटिकाओं के घनत्व को बढ़ाने के लिए ग्लूकोज के बजाय सुक्रोज होता है और इस तरह जीयूवी के अवसादन की सुविधा होती है। इसके अलावा, बाहरी वातावरण में ग्लूकोज चरण विपरीत को बढ़ाता है, जिससे पुटिका अधिक आसानी से दिखाई देती है।

स्टोकेस्टिक प्रभाव जीयूवी के साथ एक समस्या से बहुत कम हैं; लेकिन यहां, सतह-से-मात्रा अनुपात अस्वीकार्य रूप से कम हो सकता है जैसे कि झिल्ली प्रोटीन (जैसे, ट्रांसपोर्टर्स) की संख्या आंतरिक चयापचय नेटवर्क के लिए सीमित हो जाती है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि प्रोटीओजीयूवी के आकार पर सटीक नियंत्रण की अनुमति नहीं देती है, लेकिन बहुमत 5-50 माइक्रोन के आकार सीमा में आती है।

अंत में, यहां प्रस्तुत कार्य अलग-अलग आकारों के लिपिड पुटिकाओं में झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन और एंजाइम एनकैप्सुलेशन का व्यापक अवलोकन प्रदान करता है। हम एटीपी के संश्लेषण के लिए कार्यात्मक पुटिकाओं के निर्माण और अमीनो एसिड और ग्लिसरॉल जैसे सरल अग्रदूतों से बिल्डिंग ब्लॉक का प्रदर्शन करते हैं। जीयूवी में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, लेकिन यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल नीचे-अप सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुसंधान में आगे के विकास का मार्ग प्रशस्त करते हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक pBAD-PercevalHR जीन की क्लोनिंग के लिए आदित्य अय्यर और प्रोटीन उत्पादन और शुद्धिकरण में सहायता के लिए Gea Schuurman-Wolters को धन्यवाद देते हैं। अनुसंधान को NWO गुरुत्वाकर्षण कार्यक्रम "बिल्डिंग ए सिंथेटिक सेल" (BaSyC) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

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References

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Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

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