Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Konstruksjon av metabolske nettverk utenfor likevekt i vesikler i nano- og mikrometerstørrelse

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

Vi presenterer en protokoll for rekonstituering av membranproteiner og innkapsling av enzymer og andre vannløselige komponenter i lipidvesikler av submikrometer- og mikrometerstørrelse.

Abstract

Vi presenterer en metode for å inkorporere komplekse proteinnettverk i vesikler, som involverer integrerte membranproteiner, enzymer og fluorescensbaserte sensorer, ved bruk av rensede komponenter. Denne metoden er relevant for design og konstruksjon av bioreaktorer og studiet av komplekse metabolske reaksjonsnettverk utenfor likevekt. Vi starter med å rekonstituere (flere) membranproteiner til store unilamellære vesikler (LUV) i henhold til en tidligere utviklet protokoll. Vi innkapsler deretter en blanding av rensede enzymer, metabolitter og fluorescensbaserte sensorer (fluorescerende proteiner eller fargestoffer) via fryse-tine-ekstrudering og fjerne ikke-inkorporerte komponenter ved sentrifugering og/eller størrelseseksklusjonskromatografi. Ytelsen til de metabolske nettverkene måles i sanntid ved å overvåke ATP/ADP-forholdet, metabolittkonsentrasjonen, intern pH eller andre parametere ved fluorescensavlesning. Våre membranproteinholdige vesikler med en diameter på 100-400 nm kan omdannes til gigantiske unilamellære vesikler (GUV), ved å bruke eksisterende, men optimaliserte prosedyrer. Tilnærmingen muliggjør inkludering av løselige komponenter (enzymer, metabolitter, sensorer) i mikrometerstore vesikler, og oppskalerer dermed volumet av bioreaktorene med størrelsesordener. Det metabolske nettverket som inneholder GUV-er er fanget i mikrofluidiske enheter for analyse ved optisk mikroskopi.

Introduction

Feltet nedenfra og opp syntetisk biologi fokuserer på å konstruere (minimale) celler 1,2 og metabolske bioreaktorer for bioteknologiske 3,4 eller biomedisinske formål 5,6,7,8. Konstruksjonen av syntetiske celler gir en unik plattform som lar forskere studere (membran) proteiner under veldefinerte forhold som etterligner de i innfødte miljøer, noe som muliggjør oppdagelsen av fremvoksende egenskaper og skjulte biokjemiske funksjoner til proteiner og reaksjonsnettverk9. Som et mellomtrinn mot en autonomt fungerende syntetisk celle, utvikles moduler som fanger opp essensielle trekk ved levende celler som metabolsk energibevaring, protein- og lipidsyntese og homeostase. Slike moduler forbedrer ikke bare vår forståelse av livet, men har også potensielle anvendelser innen medisin8 og bioteknologi10.

Transmembrane proteiner er kjernen i praktisk talt ethvert metabolsk nettverk når de transporterer molekyler inn eller ut av cellen, signaliserer og reagerer på kvaliteten på miljøet, og spiller en rekke biosyntetiske roller. Dermed krever konstruksjonen av metabolske moduler i syntetiske celler i de fleste tilfeller rekonstituering av integrerte og/eller perifere membranproteiner til et membrandobbeltlag sammensatt av spesifikke lipider og høy integritet (lav permeabilitet). Håndteringen av disse membranproteinene er utfordrende og krever spesifikk kunnskap og eksperimentelle ferdigheter.

Flere metoder er utviklet for å rekonstituere membranproteiner i fosfolipidvesikler, oftest med det formål å studere funksjonen11,12, regulering13, kinetiske egenskaper14,15, lipidavhengighet15,16 og/eller stabilitet17 til et spesifikt protein. Disse metodene involverer rask fortynning av vaskemiddeloppløst protein til vandige medier i nærvær av lipider18, fjerning av vaskemidler ved å inkubere vaskemiddeloppløselig protein med vaskemiddeldestabiliserte lipidvesikler og absorpsjon av vaskemiddel(e) på polystyrenperler19, eller fjerning av vaskemidler ved dialyse eller størrelseseksklusjonskromatografi20. Organiske løsningsmidler har blitt brukt til å danne lipidvesikler, for eksempel via dannelse av olje-vann-interfaser21, men flertallet av integrerte membranproteiner inaktiveres når de utsettes for slike løsningsmidler.

I laboratoriet vårt rekonstituerer vi for det meste membranproteiner ved vaskemiddelabsorpsjonsmetoden for å danne store unilamellære vesikler (LUV)19. Denne metoden tillater samrekonstituering av flere membranproteiner og innkapsling i vesikkellumen av enzymer, metabolitter og sonder22,23. De membranproteinholdige LUV-ene kan omdannes til gigantiske unilamellære vesikler (GUV) med/uten innkapsling av vannløselige komponenter, ved bruk av enten elektroformasjon24 eller gelassistert hevelse25 og spesifikke forhold for å bevare integriteten til membranproteinene26.

Denne artikkelen presenterer en protokoll for rekonstituering i LUV-er av et metabolsk nettverk utenfor likevekt som regenererer ATP gjennom nedbrytning av L-arginin til L-ornitin27. Dannelsen av ATP er koblet til produksjonen av glyserol-3-fosfat (G3P), en viktig byggestein for fosfolipidsyntese22,28. Den metabolske veien består av to integrerte membranproteiner, en arginin/ornitin (ArcD) og en G3P/Pi-antiporter (GlpT). I tillegg kreves tre løselige enzymer (ArcA, ArcB, ArcC) for resirkulering av ATP, og GlpK brukes til å omdanne glyserol til glyserol 3-fosfat, ved bruk av ATP fra nedbrytningen av L-arginin, se figur 1 for en skjematisk oversikt over banen. Denne protokollen representerer et godt utgangspunkt for fremtidig konstruksjon av enda mer komplekse reaksjonsnettverk - for syntese av lipider eller proteiner eller deling av celler. Lipidsammensetningen til vesiklene støtter aktiviteten til et bredt utvalg av integrerte membranproteiner og er optimalisert for transport av forskjellige molekyler inn i eller ut av vesiklene 27,29,30.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over veien for ATP-produksjon og syntese og utskillelse av glyserol 3-fosfat, klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kort sagt, rensede membranproteiner (oppløst i dodecyl-β-D-maltosid, DDM) tilsettes til forhåndsformede lipidvesikler som har blitt destabilisert med Triton X-100, noe som gjør det mulig å sette inn proteinene i membranen. Vaskemiddelmolekylene fjernes deretter (sakte) ved tilsetning av aktiverte polystyrenperler, noe som resulterer i dannelse av godt forseglede proteoliposomer. Løselige komponenter kan deretter tilsettes vesiklene og innkapsles via fryse-tine-sykluser, som fanger molekylene i prosessen med membranfusjon. De oppnådde vesiklene er svært heterogene og mange er multilamellære. De ekstruderes deretter gjennom et polykarbonatfilter med en porestørrelse på 400, 200 eller 100 nm, noe som gir mer jevne vesikler; Jo mindre porestørrelsen er, desto mer homogene og unilamellære er vesiklene, men til prisen av et mindre indre volum. Ikke-inkorporerte proteiner og små molekyler fjernes fra den eksterne løsningen ved størrelseseksklusjonskromatografi. ProteoGUL-ene kan omdannes til vesikler i mikrometerstørrelse ved gelassistert hevelse, og disse proteoGUVene blir deretter samlet og fanget i en mikrofluidisk brikke for mikroskopisk karakterisering og manipulasjon. Figur 2 viser en skjematisk oversikt over hele protokollen.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over protokollen for rekonstituering av membranproteiner og innkapsling av enzymer og vannløselige komponenter i lipidvesikler av submikrometer (UV) og mikrometerstørrelse (GUV). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Rekonstituerings- og innkapslingsprotokollene fungerer bra og funksjonaliteten til proteinene beholdes, men proteoGUL-ene og proteoGUV-ene er heterogene i størrelse. Mikrofluidiske tilnærminger 31,32 tillater dannelse av vesikler i mikrometerstørrelse som er mer homogene i størrelse, men funksjonell rekonstituering av membranproteiner er generelt ikke mulig fordi gjenværende løsningsmiddel i dobbeltlaget inaktiverer proteinene. ProteoLÚVene varierer i størrelse fra 100 til 400 nm, og ved lave konsentrasjoner av enzymer kan innkapslingen føre til vesikler med ufullstendige metabolske veier (stokastiske effekter; se figur 3). LUV-er er ideelle for å konstruere spesifikke metabolske moduler, som vist her for produksjon av ATP og byggesteiner som G3P. Slike proteoLIV-er kan potensielt innkapsles i GUV-er og tjene som organelllignende rom for vertsvesiklene.

Figure 3
Figur 3: Antall molekyler per vesikkel med en diameter på 100, 200 eller 400 nm. (A) Når de innkapslede proteinene (enzymer, prober) er i området 1-10 μM. (B) Rekonstitueringen gjøres ved 1 til 1 000, 1 til 10 000 og 1 til 100 000 membranproteiner per lipid (mol/mol). Vi antar at molekyler er innkapslet i de angitte konsentrasjonene og inkorporert i membranen ved disse protein-til-lipid-forholdene. For noen enzymer har vi sett at de binder seg til membraner, noe som kan øke deres tilsynelatende konsentrasjon i vesiklene. Forkortelse: LPR = Lipid-Protein-Ratio Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generell forberedelse

  1. Kjemikalier
    1. Løs opp lipider (i pulverform) til 25 mg/ml i CHCl3 for å lage forhåndsformede liposomer.
      MERK: Det er å foretrekke å tilberede ferske lipider, men stamløsningene kan også lagres ved -20 °C i noen uker. Å jobbe med lipider i pulverform er mer nøyaktig enn å bruke lipider som allerede er oppløst i CHCl3. CHCl3 skal håndteres ved hjelp av glasspipetter og/eller sprøyter og oppbevares i glassbeholdere da CHCl3 løser opp plast.
    2. Løs opp små molekyler (nukleotider, aminosyrer, fluorescenssonder) for innkapslingsprosedyren i 50 mM KPi (buffer A, se tabell 1) og juster pH til 7,00 ± 0,01. Løs opp MgCl2 i avionisert vann for å unngå dannelse av magnesiumfosfatutfellinger.
      MERK: Stamløsninger kan lagres ved -20 °C i noen uker, med unntak av DTT, som tilberedes ferskt på eksperimentdagen.
    3. Oppløs ionoforer (f.eks. valinomycin, nigericin) i enten DMSO eller EtOH ved en lagerkonsentrasjon på 100-500 μM. Oppbevares ved -20 °C i noen uker; unngå fordampning.
      MERK: DMSO er ikke flyktig og foretrekkes derfor fremfor EtOH. Bruk hetteglass av glass i stedet for plast for å unngå at ionoforene fester seg til overflaten av hetteglassene.
  2. Buffere
    1. Forbered ferske buffere på forsøksdagen (tabell 1). Oppbevares ikke lenger enn 24 timer.
  3. Rensing av løselige proteiner
    1. Express ArcA, ArcB, ArcC (vi bruker en spesifikk variant kalt ArcC1), PercevalHR og GlpK som beskrevet tidligere 27,28,33. Sørg for å tilsette 10 % v/v glyserol til cellelysebufferen, noe som forbedrer stabiliteten til proteinene. Rens de løselige proteinene som beskrevet 27,28,33 og kort rapportert nedenfor.
    2. Tin 10 ml cellelysat (~5 g våtvekt) i et isvannsbad. I mellomtiden, påfør 2 ml (1 CV) Ni2+-Sepharose-harpiks på en gravitasjonsstrømningskolonne (20 ml kapasitet) med avionisert vann (12 CV) og buffer B (4 CV) for å vaske. Overfør det tine lysatet til is; arbeid på is, med mindre annet er oppgitt.
    3. Tilsett imidazol til en endelig konsentrasjon på 10 mM til det tinte lysatet, og hell deretter løsningen på tyngdekraft-strømningskolonnen. Inkuber i 1 time ved 4 °C med forsiktig nutering.
    4. Etter 1 time, kast gjennomstrømningen og vask harpiksen med buffer C (20 CVs).
    5. Eluer proteinet med buffer D. Bruk 60 % CV for det første elueringstrinnet, etterfulgt av 4-6 trinn med 40 % CV.
    6. Bestem proteinkonsentrasjonen og tilsett Na-EDTA til en endelig konsentrasjon på 5 mM.
    7. Spinn ned det rensede proteinet i en nedkjølt sentrifuge (maks hastighet, 10 minutter, 4 °C). Rens ved størrelseseksklusjonskromatografi ved hjelp av buffer E. Slå sammen elueringsfraksjonene og konsentrer dem til ~10 mg/ml med et konsentrerende filter med en grenseverdi på 30 kDa. Forbered alikvoter av passende størrelse (~ 20 μL), hurtigfrys med flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C for senere bruk.
      MERK: Det er viktig å konsentrere enzymene til 50-100 μM for å minimere volumet som trengs for innkapslingen.
  4. Rensing av membranproteiner
    1. Overexpress ArcD og GlpT som beskrevet tidligere 22,27,33. Sørg for å tilsette 10 % v/v glyserol til cellelysebufferen; for rensing av ArcD, inkluder 2 mM reduksjonsmiddel (f.eks. DTT) i bufferen. Rens de affinitetsmerkede proteinene med Ni2+-Sepharose-kromatografi.
      1. Tin en alikvot av rå membranvesikler (10-20 mg totalt membranprotein) i et isvannsbad.
        NOTAT: Når den er tint, arbeid alltid på is med mindre annet er oppgitt. Se tabell 1 for bufferne som brukes i dette avsnittet.
      2. Tilsett membranvesiklene til buffer F (ArcD) eller buffer G (GlpT) til et sluttvolum på 6 ml. Inkuber prøven i 1 time ved 4 °C med forsiktig nutering.
      3. Separer de oppløste membranproteinene fra membranrestene ved ultrasentrifugering (337 000 × g, 30 min, 4 °C). I mellomtiden, påfør 0,25 ml (1 CV) Ni2+-Sepharose-harpiks på en gravitasjonsstrømningskolonne (10 ml kapasitet) med avionisert vann (40 CVs) og 20 CVs buffer H (ArcD) eller buffer I (GlpT).
      4. Hell det oppløste proteinet på tyngdekraftsstrømningskolonnen og tilsett imidazol til en endelig konsentrasjon på 10 mM. Inkuber i 1 time ved 4 °C med forsiktig nutering.
      5. Etter 1 time, kast gjennomstrømningen og vask harpiksen med 20 CV-er buffer J (ArcD) eller buffer K (GlpT).
      6. Eluer membranproteinet i trinn på 60 % CV (1st) og 40 % CV (2nd-6 th) med Buffer L (ArcD) eller Buffer M (GlpT).
      7. Bestem proteinkonsentrasjonen og fortsett til pkt. 2.2. for membranrekonstituering.
        MERK: Størrelseseksklusjonsrensingen utføres ikke nødvendigvis for membranproteiner siden membranrekonstitusjonen gir en lignende rensing. Trinn 1.4 og 2.2 kan utføres på 1 arbeidsdag. Start med proteinrensing (trinn 1.4) om morgenen og fortsett med rekonstituering (trinn 2.2) om ettermiddagen. Rekonstituering avsluttes neste dag (se pkt. 2.2 for detaljer). STOPPPUNKT: Renset og DDM-oppløst ArcD og GlpT kan lagres ved -80 oC for senere bruk, men dette gjelder ikke for alle membranproteiner. Forbered alikvoter av passende størrelse (50-200 μL), hurtigfrys med flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C for senere bruk. Disse proteinene er aktive i flere måneder når de lagres ved -80 °C i nærvær av 10 % v/v glyserol.
  5. Klargjøring av β-kasein for passiveringsformål
    1. Resuspender 100 mg β-kasein i 20 ml avionisert vann og titrer med 1 M NaOH til β-kaseinet er fullstendig oppløst. Tilsett deretter 1 M eddiksyre for å justere pH til 7,0 og fyll volumet til 50 ml med avionisert vann. Filtrer løsningen gjennom et 0,2 μm sprøytefilter og lag alikvoter på 500 μL.
      MERK β-kaseinet kan oppbevares ved -20 °C i 6 måneder. Det anbefales å filtrere β-kaseinet igjen før bruk for å unngå at β-kaseinaggregater tetter til mikrofluidbrikken.

Buffer Komposisjon
Buffer A 50 mM KPi pH 7,0
Buffer B 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glyserol, 10 mM imidazol, pH 7,5
Buffer C 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glyserol, 50 mM imidazol, pH 7,5
Buffer D 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glyserol, 500 mM imidazol, pH 7,5
Buffer E 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v glyserol, pH 7,0
Buffer F 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5 % vekt/volum DDM, 10 % v/v glyserol, 2 mM β-merkaptoetanol, pH 7,5
Buffer G 50 mM Tris-HCl, 0,5 % vekt/volum DDM, 20 % v/v glyserol, pH 8
Buffer H 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02 % w/v DDM, 10 % v/v glyserol, 2 mM β-merkaptoetanol, 10 mM imidazol, pH 7,5
Buffer I 50 mM Tris-HCl, 0,04 % vekt/volum DDM, 20 % v/v glyserol, 10 mM imidazol, pH 8,0
Buffer J 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02 % vekt/volum DDM, 10 % v/v glyserol, 2 mM β-merkaptetanol, 50 mM imidazol, pH 7,5
Buffer K 50 mM Tris-HCl, 0,04 % vekt/volum DDM, 20 % v/v glyserol, 50 mM imidazol, pH 8
Buffer L 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02 % w/v DDM, 10 % v/v glyserol, 2 mM β-merkaptoetanol, 500 mM imidazol, pH 7,5
Buffer M 50 mM Tris-HCl, 0,04 % w/v DDM, 20 % v/v glyserol, 500 mM imidazol, pH 8
Buffer N 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Buffer O 50 mM KPi, 0,5 mM L-ornitin, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7,0
Buffer P 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM glukose (x er variert for å matche osmolariteten til det eksterne og interne mediet)
Buffer Q 50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM sukrose, 2 mM DTT
Buffer R 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginin, x mM glukose

Tabell 1: Buffere brukt i denne protokollen.

2. Proteoliposomer: rekonstituering av rensede membranproteiner til forhåndsformede lipidvesikler

  1. Dag 1
    1. Fremstilling av forhåndsformede lipidvesikler
      1. Velg lipidsammensetningen (f.eks. syntetiske fosfolipider, E. coli polare lipider) på grunnlag av kravene til membranproteinene.
        MERK: En blanding av DOPE, DOPG og DOPC (25:25:50 mol%) er et godt utgangspunkt, men steroler eller kardiolipin kan være nødvendig for noen proteiner; For gjærplasmamembranproteiner inkluderer vi palmitoyl-oleoyllipider i stedet for dioleoyl30. En dope-, dopg- og DOPC-blanding (25:25:50 mol%) er tilstrekkelig for rekonstituering av ArcD og GlpT.
      2. Bland de ønskede lipidene (oppløst i CHCl3) og fordamp CHCl3 i en roterende fordamper til det dannes en lipidfilm. Vask lipidene ved å tilsette dietyleter i samme volum som CHCl3. Fordamp dietyleteren og få en tørr lipidfilm.
      3. Resuspender lipidfilmen til 20 mg/ml totale lipider i vandige medier (buffer A). Start med halvparten av det totale volumet og rist forsiktig; Overfør deretter lipidene forsiktig til et rent rør eller flaske av tilstrekkelig størrelse. Tilsett fersk buffer A i kolben og gjenta prosedyren for å løse opp de gjenværende lipidene og overføre dem til et nytt kar. Tilsett ekstra buffer A for å nå en endelig konsentrasjon på 20 mg/ml.
      4. Soniker de resuspenderte lipidene ved hjelp av en sondesoniker. Bruk følgende parametere for en sonikerspiss med en diameter på 6 mm: 4 μm intensitet, 70% amplitude, 5 s på, 45 s av, 16 sykluser. Senk lipidene i et isvannsbad som inneholder EtOH for å unngå overoppheting ved sonikering.
      5. Flash-frys den sonikerte prøven (volum på 40 ml i et 50 ml sentrifugerør) i flytende nitrogen, og tine prøven i et vannbad ved romtemperatur. Gjenta en gang; Deretter alikvoterer du liposomene i ønskede volumer (f.eks. 1 ml eller 20 mg totale lipider i et 1,5 ml plastrør).
        STOPPPUNKT: Prosedyren kan stoppes på dette tidspunktet. Hurtigfrys hver alikvot en gang til (tredje syklus) og oppbevar i flytende nitrogen i opptil noen måneder. Pass på å stikke hull på rørlokkene to ganger med en nål for å unngå eksplosjon av røret ved rask koking av flytende nitrogen.
  2. Dag 2
    1. Rekonstituering av rensede membranproteiner til forhåndsformede liposomer
      1. Tin en alikvot liposomer (20 mg totale lipider) i vannbad ved romtemperatur. I mellomtiden, klargjør en ekstruder ved å bruke et filter etter eget valg (f.eks. polykarbonat, porediameter på 400 nm); forhåndsbalanser ekstruderen med buffer A; og legg de tine liposomene ('melkeaktig løsning») inn i ekstruderen og før dem 13 ganger gjennom filteret. Samle de ekstruderte liposomene (nå store unilamellære vesikler; "ugjennomsiktig løsning") i en glass- eller plastbeholder av tilstrekkelig størrelse (f.eks. 15 ml). Fortynn liposomene til 4 mg/ml med buffer A supplert med 2 mM DTT.
      2. Overfør 1 ml 4 mg/ml liposomer til en 1 ml gjennomsiktig kyvette. I et spektrofotometer måler du den opprinnelige optiske tettheten ved 540 nm. Hell den målte prøven tilbake og tilsett 50 μL 10 % v/v Triton X-100 til liposomene.
        MERK: Et titreringsvolum på 50 μL 10% Triton-X100 er egnet for 20 mg lipider i et volum på 5 ml; tilsetningen av Triton X-100 vil fortynne lipidene med ~5%. Juster titreringsvolumet når du arbeider med forskjellige mengder liposomer. For stabile optiske tetthetssignaler, titrer liposomene med Triton X-100 ved romtemperatur.
      3. Gjenta trinn 2.2.1.2 og merk når en maksimal optisk tetthet er nådd (Rsat). Fortsett videre med titreringen til en optisk tetthet på ca. 60 % Rsat er nådd (figur 4). Hell de vaskemiddeldestabiliserte vesiklene tilbake i glass-/plastrøret (det endelige volumet er nå ca. 5.2 ml), overfør prøven til is og la den avkjøles.
      4. Tilsett det rensede membranproteinet(e) til de destabiliserte liposomene for å nå et ønsket lipid-til-protein-forhold (vekt/vekt). Bruk et forhold på 400:1 ned til 100:1 vekt/vekt; siden både ArcD og GlpT har molekylvekter på ~55 kDa, tilsvarer et lipid-til-protein-forhold på 400:1 w/w ~30 000 lipider per protein, og ~ 50 molekyler ArcD og GlpT hver per vesikler med en diameter på 400 nm.
        MERK: Her bruker vi 400:1 vekt/vekt, tilsvarende 50 μg av hvert protein per 20 mg lipider.
      5. Nuter prøvene ved 4 °C i 15 minutter for å la membranproteinene settes inn i den destabiliserte liposomale membranen.
      6. For å fjerne vaskemiddelet, tilsett 200 mg tørre polystyrenperler, tilberedt i henhold til produsentens instruksjoner. Møt ved 4 °C i ytterligere 15 minutter.
        MERK: En mengde på 200 mg tørre perler er egnet for 20 mg lipider, men bør justeres når en annen prøvestørrelse brukes.
      7. Gjenta trinn 2.2.1.6 2x, for totalt tre tilsetninger av polystyrenperler. Inkuber deretter over natten ved 4 °C med forsiktig nutering.
  3. Dag 3
    1. Gjenta trinn 2.2.1.6; men denne gangen, nutate ved 4 °C i 1 time.
    2. Fest en tom gravitasjonsstrømskolonne (10 ml kapasitet) over et tomt 6,5 ml ultrasentrifugerør på is. Hell prøven i kolonnen og samle proteoliposomene i ultrasentrifugerøret (perlene beholdes i kolonnen).
    3. Vask perlene med 0,5 ml buffer A supplert med 2 mM DTT og samle filtratet i ultrasentrifugeringsrøret.
    4. Konsentrer proteolisomene ved ultrasentrifugering (337 000 × g, 30 min, 4 oC). Resuspender proteolisomene i et totalt volum på 200 μL (100 mg lipid/ml) i buffer A supplert med 2 mM DTT; det tørre volumet av vesiklene etter sentrifugering er ~40 til 120 μL27. Del opp i alikvoter av ønsket størrelse (f.eks. tre alikvoter på 6,66 mg totale lipider).
      MERK: Alikvotstørrelsen er vilkårlig, men vil påvirke pelletsstørrelsen i senere trinn (se trinn 3.2.3.1). STOPPPUNKT: Prosedyren kan stoppes her. Hurtigfrys hver alikvot og oppbevar i flytende nitrogen i opptil noen uker. Pass på å stikke hull på rørlokkene to ganger med en nål for å unngå eksplosjon av røret ved rask koking av flytende nitrogen.

Figure 4
Figur 4: Titrering av forhåndsformede liposomer med Triton X-100. Liposomer på 5 mg lipider/ml ekstruderes gjennom et polykarbonatfilter (400 nm) i 50 mM KPi (pH 7.0) og titreres deretter med Triton X-100 (protokolltrinn 2.2.1.2). Turbiditeten til vesiklene måles ved A540. Pilen indikerer Triton X-100-konsentrasjonen der vesiklene er tilstrekkelig destabilisert for spontan innsetting av membranproteiner som beskrevet i19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Innkapsling av et metabolsk nettverk for ATP-resirkulering og glyserol 3-P-syntese i vesikler i submikronstørrelse

  1. Dag 1
    1. Blanding av komponenter
      1. For en standard innkapsling, bruk 66,6 μL proteoliposomer i et sluttvolum på 200 μL (33,33 mg/ml totale lipider). Beregn volumet av hver komponent (enzym, kofaktor) som trengs for å nå ønsket konsentrasjon, tilsett disse komponentene til proteoliposomene, og juster volumet til 200 μL med buffer A (tabell 2).
        NOTAT: Proteinkonsentrasjonen kan justeres basert på det eksperimentelle oppsettet. Det bør imidlertid utvises forsiktighet med at flere kopier (>10) av hvert enzym i gjennomsnitt er tilstede per vesikkel, for å unngå uønskede stokastiske effekter. Konsentrasjoner > 1 μM er generelt trygge; 1 μM i en vesikkel med en diameter på 400 nm tilsvarer omtrent 20 kopier (figur 3).
      2. Pipettebuffer A i et tomt 1,5 ml rør og tilsett DTT, Na-ADP, MgCl2, L-ornitin (og pyranin, om nødvendig for interne pH-målinger). Tilsett deretter enzymene og bland forsiktig. Tilsett løsningen på toppen av de forhåndsformede proteoliposomene, og virvel kort på lav hastighet.
        NOTAT: Det er viktig å tilsette Na-ADP før MgCl2 for å unngå uønsket dannelse av magnesiumfosfatutfellinger. Vortexing er nødvendig for riktig blanding av den viskøse løsningen; minimer imidlertid varigheten og hastigheten for å unngå mekanisk skade på proteinene. PercevalHR og pyranin kan ikke innkapsles sammen fordi spektrene deres overlapper hverandre.
    2. Bestemmelse av intern osmolalitet
      1. Klargjør en 50 μL løsning som beskrevet i trinn 3.1.1.1, men uten proteolipasomer, og mål osmolaliteten med et frysepunktosmometer.
      2. Lag en kalibreringskurve ved hjelp av buffer (50 mM KPi pH 7.0) og varierende konsentrasjoner av salt (f.eks. NaCl eller NaCl) eller sukker. Bestem osmolyttkonsentrasjonen som samsvarer med den interne osmolaliteten (buffer N).
        NOTAT: Membranpermeable komponenter (f.eks. glyserol) kan ikke brukes til å matche den interne osmolaliteten. For proteiner oppløst i glyserolholdig buffer (f.eks. buffer E), bør den samme bufferen brukes uten glyserol. Osmolytten som er valgt for fremstilling av en iso-osmotisk ekstern buffer skal være membranugjennomtrengelig og ikke forstyrre det metabolske nettverket.
    3. Fryse-tining
      1. Hurtigfrys (i flytende nitrogen) proteolisomene sammen med de løselige komponentene, og tining i vann-isbad ved ca. 10 °C.
      2. Gjenta trinn 3.1.3.1 for totalt 5 ganger.
        STOPPPUNKT: Prosedyren kan stoppes her. Hopp over det siste tinetrinnet, og oppbevar den frosne prøven i flytende nitrogen i 1-3 dager. Pass på å stikke hull på rørlokkene 2 ganger med en nål for å unngå eksplosjon av røret ved rask koking av flytende nitrogen. Lagring i flytende nitrogen foretrekkes fremfor -80 °C for å minimere lipidoksidasjon.
  2. Dag 2
    1. Ekstrudering
      NOTAT: Alle ekstruderingstrinn utføres ved romtemperatur, da de gasstette sprøytene ellers vil lekke.
      1. Forbered en ekstruder ved å bruke et filter etter eget valg (f.eks. polykarbonat, porediameter på 400 nm). Vask ekstruderen med en løsning som inneholder samme buffer og metabolitter som brukes til innkapsling av vesiklene (f.eks. buffer O pluss 0,1 mM pyranin).
        NOTAT: Bruk en dedikert ekstruder for lasting av proteoliposomer med pyranin da fargestoffet fester seg til ekstruderoverflaten og kan forårsake forurensning i senere prøver.
      2. Legg innkapslingsblandingen i ekstruderen, og før den gjennom filteret 13x. Samle den ekstruderte løsningen i et 1,5 ml rør.
    2. Størrelseseksklusjonskromatografi (valgfritt)
      MERK: Dette trinnet utføres for å fjerne eksterne molekyler som fargestoffer som pyranin ved størrelseseksklusjonskromatografi. Hvis fargestoffer ikke er tilstede i systemet, og andre komponenter ikke forstyrrer ved lave konsentrasjoner (legg merke til at vesiklene etterpå også vaskes ved ultrasentrifugering), så trinn 3.2.2. kan hoppes over.
      1. Rehydrer Sephadex G-75-harpiks og hell den i en glasssøyle (22 cm lang, 1,5 cm bred). Balanser harpiksen med et overskudd av ekstern buffer (f.eks . buffer N).
      2. Last de ekstruderte proteoliposomene fra trinn 3.2.1.2 på den preekvilibrerte størrelseseksklusjonskromatografikolonnen og påfør en gravitasjonsstrøm av ekstern buffer. Kast det tomme volumet (ca. 7 ml); Samle deretter ti 1 ml alikvoter. Visualiser de proteoliposomholdige alikvotene ved kort eksponering for en UV-lampe. Samle fraksjonene som inneholder de fleste proteoliposomene (2-4 ml).
    3. Vask og oppheng
      1. Vask de ekstruderte proteolipsomene ved ultrasentrifugering. Fyll et 6,5 ml ultrasentrifugerør med 5,8 ml buffer N, og påfør den ekstruderte prøven på toppen. Hvis størrelseseksklusjonskromatografi ble utført, fyll røret med de samlede elueringsprøvene (2-4 ml) og tilsett buffer N til et endelig volum på 6 ml.
      2. Sentrifuger ved 337 000 × g, 30 min, 4 °C. Kast supernatanten, og tørk ultrasentrifugerøret grundig med et støvfritt vev mens du er oppmerksom på å ikke berøre pelleten. Suspender pelleten på nytt i et lite volum buffer N (200 μL). Når pelleten er helt opphengt, fyll røret opp til 6 ml med buffer N.
        NOTAT: det vil ta tid å suspendere pelleten og bør gjøres forsiktig.
      3. Gjenta trinn 3.2.3.1-3.2.3.2 2x, i totalt tre vasker, med mindre størrelseseksklusjonskromatografi utføres (i så fall er ett sentrifusjonstrinn tilstrekkelig). Til slutt, resuspender pelleten til ønsket konsentrasjon (f.eks. 5.55 mg/ml total lipid) ved å tilsette et passende volum buffer N.
        STOPPPUNKT: Proteolipsomene kan brukes umiddelbart eller oppbevares ved 4 oC i minst 48 timer. Størrelsen på ultrasentrifugerør bør velges basert på prøvestørrelsen. For en pellet på 6,66 mg totale lipider er et 6,5 ml rør passende. Vasking av 200 μL proteolipasomer (33,33 mg lipider/ml totalt; tørt pelletvolum ~40 μL)28 for 3 x 6 ml buffer fortynner de eksterne komponentene med en faktor på 100 for hvert vasketrinn. Hvis det brukes rør i forskjellige størrelser, er det ønskelig å justere antall vasker deretter.
  3. Dag 3
    1. Påvisning av ATP-syntese ved fluorescens
      1. Bland reaksjonskomponentene til et sluttvolum på 120 μL (tabell 3) i en svart kvartskyvette med et vindu på 3 x 5 mm og et minimalt indre volum på 100 μL.
        NOTAT: Ionoforer kan tilsettes for å spre elektrokjemiske ionegradienter. En blanding av valinomycin og nigericin (1 μM hver) sprer effektivt eventuelle proton- og kaliumgradienter.
      2. Forvarm prøven i et fluorometer satt til 30 °C og få eksitasjonsspektra av PercevalHR (eksitasjon 400-520 nm, båndbredde 5 nm; emisjon 550 nm, båndbredde 5 nm). Når sondesignalet er konstant, start det metabolske nettverket ved tilsetning av et overskudd av L-arginin (5-10 mM) og glyserol (400 μM) når resirkulering av ATP er koblet til syntesen av glyserol 3-fosfat. Følg reaksjonen over tid.
    2. Analyse av data
      1. Plott forholdet F500/F430 som en funksjon av tid, som er en kvalitativ indikator på ATP/ADP-forholdet. For en mer kvantitativ vurdering av ATP-dannelse, konstruer en kalibreringskurve i proteoliposomer eller bruk en komplementær tilnærming (f.eks. ATP-kvantifisering ved kjemiluminescens28).
Komponent Endelig konsentrasjon
Buffer A 50 mM KPi pH 7,0
DTT 2 mM
Na-ADP 10 mM
MgCl2 10 mM
L-ornitin 0,5 mM
Fluorescerende sonde (PercevalHR eller pyranin) henholdsvis 5,8 μM eller 0,1 mM
ArcA (Arginin deiminase) 1 μM
ArcB (Ornitin karbamoyltransferase) 2 μM
ArcC1 (karbamatkinase) 5 μM
GlpK (Glyserolkinase) 1,6 μM
Proteoliposomer 33,33 mg/ml totale lipider

Tabell 2: Innkapslingskomponenter. Komponentene er oppført i rekkefølge etter tillegg. Løselige proteiner er i buffer E; alle andre komponenter (unntatt MgCl2, i avionisert vann) er i buffer A.

Komponent Endelig konsentrasjon
Buffer K 50 mM KPi pH 7,0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Proteoliposomer (5,55 mg/ml lipider) 2,7 mg/ml lipider
Ionoforer (valinomycin, nigericin) 1 μM hver

Tabell 3: Eksperimentelle forhold. Komponentene er oppført i rekkefølge etter tillegg. Proteoliposomer er i buffer N, ionoforer i DMSO eller EtOH.

4. Oppskalering av et metabolsk nettverk for vesikler i mikrometerstørrelse

  1. Dag 1
    1. Forberedelse av mikrofluidisk brikke
      NOTAT: Dette eksperimentet bruker en mikrofluidisk enhet utviklet av Robinson et al.34. Andre design av mikrofluidiske brikker er tilgjengelige 35,36,37 og kan enkelt implementeres i denne protokollen.
      1. Skjær en 200 μL pipettespiss en tredjedel fra bunnen og sett den nederste delen av spissen inn i en forhåndslaget mikrofluidisk fangstenhet.
      2. Til innløpsreservoaret til brikken, tilsett 400 μL β-kaseinløsning (2 mg/ml; se trinn 1.5), og pass på å forhindre innføring av luft på dette trinnet. Plasser en 96-brønns tallerkenbøtte og legg til en laboratorievev i en konisk rørsentrifuge på bordet. Plasser brikken på toppen av vevet og sentrifuger i 6 minutter ved 900 × g for å tillate passivering av mikrofluidbrikken. Etter sentrifugetrinnet skal væskenivået være likt på innløpsreservoaret og utløpsspissen til mikrofluidbrikken; Se etter lekkasje av brikken. Inkuber β-kaseinløsningen i mikrofluidikkbrikken i minst 30 minutter.
      3. Fjern det meste av passiveringsløsningen uten å tilføre luft og tilsett 400 μl vaskebuffer (buffer P). Plasser brikken på 96-brønns platebøtta og sentrifuger ved 900 × g i 6 minutter. La brikken ligge i vaskeløsningen til bruk (i maksimalt 4 timer).
  2. Gelforberedelse for fremstilling av proteo-GUV
    MERK: Følgende beskrivelse er hentet og tilpasset fra25,38.
    1. Løs opp 0,5 % (vekt/vekt) av en agarose med lav geleringstemperatur (LGT) i avionisert vann ved å varme opp løsningen i mikrobølgeovnen; Forsikre deg om at agarosen er helt oppløst og unngå å koke løsningen. Oppbevar agarosen ved 50 °C til videre bruk.
      MERK: Oppløst agarose kan oppbevares ved romtemperatur i flere uker. For å bruke agarosen på nytt, smelt ganske enkelt gelen med en mikrobølgeovn.
    2. Ta to objektive lysbilder og tegn omrisset av avstandsstykket på lysbildene. Gjør objektglassene hydrofile ved plasmarengjøring, bruk plasma med høyt oksygeninnhold i 1 min.
    3. Tilsett LGT-agarose på toppen av objektglasset til det er helt dekket med agarose (~500 μL); Vipp deretter objektglasset i en vinkel på 90 ° og tøm overflødig agarose på et vev. La objektglassene stå i 30 minutter ved 50 °C.
    4. Ta proteoliposomer lagret i flytende nitrogen (avsnitt 3) og tin på is. Fortynn vesiklene til 5 mg/ml lipider ved hjelp av buffer Q.
      MERK: Proteoliposomer fremstilt i avsnitt 3 inneholder ikke løselige proteiner og kan tilberedes i god tid hvis de oppbevares i flytende nitrogen. Når du arbeider med proteoGUV-er, sørg for å alltid filtrere arbeidsløsningene for å forhindre tilstopping av mikrofluidenheten.
    5. Soniker proteo-liposomene ved hjelp av en håndholdt sondesoniker med en 1 mm sonde. Soniker i 10 sykluser med 0,5 s på og 0,5 s av ved 70% amplitude. Hold vesiklene, heretter referert til som proteoSUV-er, på is i 30 s, og gjenta sonikeringsprosessen 5x.
    6. Fyll en 100 μL sprøyte (i en håndholdt LCP-dispenser) med proteo-SUV-fjæringen. Sett inn 0,5 μL dråper av proteo-SUV-er på den tidligere tilberedte agarosegelen; Vær forsiktig så du ikke forstyrrer agaroselaget og holder nok avstand til å forhindre at dråper smelter sammen.
      MERK Bruk av en håndholdt LCP-dispenser tillater dråpeavsetning på en reproduserbar måte, men alternative pipetteringssystemer kan også brukes. Flekker med en glasskapillær er mindre egnet fordi det forstyrrer den tørkede agarosegelen.
    7. Tørk SUV-dråpene på ~10 minutter ved å bruke en nitrogenstrøm i stedet for trykkluft for å redusere muligheten for å oksidere lipidene.
    8. Forbered 1 ml av en 1,25x konsentrert buffer O (tabell 4) i buffer A og pass gjennom et 0,2 μm celluloseacetatfilter. Ta 800 μL av den 1,25x konsentrerte løsningen og tilsett de løselige enzymene og sondene til en konsentrasjon som angitt i tabell 4. Bruk filtrert avionisert vann for å gjøre det endelige volumet til 1 ml.
    9. Tilbered 100 μL hevelsesløsning som inneholder alle komponentene i tabell 4, med unntak av proteiner og glyserol. Mål osmolaliteten til hevelsesløsningen ved hjelp av et 3-punkts kalibrert frysepunktosmometer.
      NOTAT: Forbered 100 μL hevelsesløsning uten protein og glyserol for å bestemme osmolaliteten til denne løsningen nøyaktig. Glyserol, som er tilstede i proteinløsningen, påvirker osmolaliteten, men i GUV-er diffunderer glyserol raskt over membranen og fører bare til forbigående osmotiske forskjeller.
    10. Sett sammen GUV-hevelseskammeret ved å lage en sandwich av to objektivglass som inneholder gelen og tørkede SUV-er med et 1,5 eller 3,0 mm tykt teflonavstandsstykke i mellom. Tilsett deretter hevelsesløsningen i kammeret gjennom det lille hullet i siden ved hjelp av en sprøyte og nål.
      NOTAT: Volumet på hevelsesløsningen kan justeres ved å variere avstandsstykkene fra 1,5 til 3,0 mm.
  3. Hevelse i vesikler og høsting av GUV-er
    1. Tillat hevelse av vesikler ved å sette kammeret på 22 °C i minst 30 minutter.
      NOTAT: Hevelsen i vesiklene kan følges av lysmikroskopi, (f.eks. et bordfasekontrastmikroskop eller et widefield fluorescensmikroskop) hvis proteinene eller lipidene er fluorescerende merket.
    2. Høst GUV-ene fra gelen ved å påføre forsiktig fysisk omrøring ved å banke kammeret på en solid overflate (f.eks. laboratoriebenk); ta ut en tredjedel av volumet og bruk den resulterende luftboblen til å forsiktig indusere bevegelse til den gjenværende væsken, og dermed løsne GUV-ene fra gelen.
    3. Mens GUV-ene hovner opp, klargjør du buffer P og matcher osmolaliteten med hevelsesløsningen ved å justere konsentrasjonen av glukose. Filtrer bufferen gjennom et 0,2 μm sprøytefilter.
      NOTAT: Generelt bør vaske- og substratløsningen holdes innenfor ± 5 mosmol/kg. Enhver løsning som passerer gjennom brikken bør være veldig ren, da forurensninger kan tette kanalene. Lag nye buffere hver gang eller oppbevar tilberedte buffere ved -20 °C og filtrer før bruk.
  4. Fangst av GUV-ene for mikroskopieksperimenter
    1. Monter den passiverte mikrofluidiske brikken på sample stage av mikroskopet. Se etter mulige defekter (f.eks. lekkasjer, innestengt luft, tette kanaler).
      MERK: Kontroll av brikken kan gjøres i god tid før bruk, slik at en ny brikke kan klargjøres om nødvendig.
    2. Koble slangen med en bøyd nål til utløpet av reservoaret og koble den andre enden til en 1 ml sprøyte. Monter sprøyten på en pumpe og still inn strømningshastigheten til maksimalt 10 μL/min.
    3. Fjern vaskebufferen fra beholderen (trinn 4.1.1.3) og erstatt den med nytt medium (buffer P). Start strømmen av buffer gjennom brikken ved å infundere via sprøyten ved 1-10 μL/min. Vask med minst 80 μL osmotisk balansert vaskebuffer (buffer P).
    4. Fjern overflødig vaskebuffer fra reservoaret og tilsett (proteo)GUV-ene i reservoaret. Juster strømningshastigheten til 0.1-1 μL/min for å la GUV-ene strømme gjennom brikken. Overvåk brikken over tid til nok GUV-er har blitt fanget i brikken.
      NOTAT: Vesikler med relativt store mengder (>20 mol%) ladede lipider som fosfatidylglyserol (PG), fosfatidylserin (PS) eller fosfatidinsyre (PA) eller ikke-dobbeltlagsdannende lipider som fosfatidyletanolamin (PE) introduseres med en lavere strømningshastighet gjennom brikken for å forhindre sprengning. Vesikler sammensatt av rent fosfatidylkolin (PC) har en tendens til å være mer stabile.
    5. Fjern overflødig GUV-løsning og tilsett vaskebuffer P, ved å bruke en konstant strøm på 0,1-1 μL/min, for å bytte ut det eksterne mediet og vaske de fangede GUV-ene i minst 1 time for å fjerne ikke-innkapslede forbindelser og senke bakgrunnsfluorescensen når en fluorofor er innkapslet. Overvåk bakgrunnsfluorescensen over tid; Hvis bakgrunnsfluorescensen ikke avtar, kan brikken bli blokkert.
    6. Lokaliser feller med tilstrekkelige mengder vesikler og lagre posisjonene deres. Bruk innstillingene på mikroskopet (f.eks. laserintensitet, forsterkning, bølgelengde) og start et tidsserieeksperiment.
    7. Tilsett osmotisk balansert substratløsning (buffer R) til reservoaret og start en strømningshastighet på 0,5 μL/min.

Buffer L-komponenter
Komponent 1,25 x konsentrasjon Arbeidskonsentrasjon
Buffer A 62,5 mM KPi pH 7,0 50 mM KPi pH 7,0
Sukrose 125 mM 100 mM
DTT 2,5 mM 2 mM
Na-ADP 12,5 mM 10 mM
MgCl2 12,5 mM 10 mM
L-ornitin 0,625 mM 0,5 mM
Innkapsling komponenter
Pyranin eller PercevalHR 1 mM eller 20 μM
ArcA (Arginin deiminase) 1 μM
ArcB (Ornitin karbamoyltransferase) 2 μM
ArcC1 (karbamatkinase) 5 μM

Tabell 4: Buffer O og innkapslingskomponenter. Komponentene er oppført i rekkefølge etter tillegg. Alle komponenter (unntatt MgCl2, i avionisert vann) er i buffer A. Innkapslingskomponenter er oppført i rekkefølge etter tilsetning. Alle vannløselige proteiner er i buffer E.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekonstituering av oppløste membranproteiner i liposomer krever destabilisering av forhåndsformede vesikler. Tilsetning av lave mengder Triton X-100 resulterer i utgangspunktet i en økning av absorbansen ved 540 nm (A540) på grunn av en økning i lysspredning ved hevelse i vesiklene (figur 4). Den maksimale A540-verdien er punktet der liposomene er mettet med vaskemiddel (Rsat), hvoretter ytterligere tilsetning av Triton X-100 vil resultere i delvis oppløselighet av vesiklene. Ved Rsol er liposomene fullstendig oppløst (figur 4). For rekonstituering av membranproteiner bruker vi vanligvis vesikler destabilisert til 60 % utover Rsat (indikert med pil).

Det rekonstituerte membranproteinet ArcD brukes til å transportere L-arginin inn i og L-ornitin ut av vesiklene og brukes sammen med de innkapslede enzymene ArcA, ArcB og ArcC for å resirkulere ATP fra ADP og uorganisk fosfat. GlpT er en glyserol 3-fosfat / fosfat antiporter som sammen med GlpK er nødvendig for syntese (og utskillelse) av glyserol 3-fosfat fra glyserol pluss ATP produsert ved L-arginin-nedbrytningen. Tilsetningen av 5 mM L-arginin ved t = 0 til proteoliposomene resulterer i en bratt økning i forholdet mellom PercevalHR-fluorescensen ved 500 og 430 nm eksitasjon39, som gjenspeiler ATP/ADP-forholdet inne i vesiklene (figur 5). Ved tilsetning av glyserol brukes ATP til syntese av glyserol 3-fosfat, noe som resulterer i en senking av ATP / ADP-forholdet28. Nedbrytningen av L-arginin fører også til pH-endringer, som kan kvantifiseres ved bruk av pyranin eller pHluorin27.

Figure 5
Figur 5: Resirkulering av ATP ved nedbrytningsveien for L-arginin. LUV-er ved 2,7 mg lipid/ml plasseres i en kyvette og forholdet mellom fluorescens ved 500 nm og 430 nm registreres. 5 mM L-arginin tilsettes ved t = 0. F500/F430-forholdet er et mål på ATP/ADP-forholdet inne i vesiklene. Forkortelse: LUVs = store-unilamellære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De ATP-produserende UV-ene kan også brukes til å danne GUV-er. Rehydrering av tørkede proteo-LUV-er på en LGT-agarosegel resulterer i dannelse av vesikler på mikrometerstørrelse (figur 6). Dannelsen av proteo-GUV-er i de tørkede LUV-flekkene avhenger sterkt av den lokale konsentrasjonen av lipider og graden av dehydrering. Noen områder har store flekker med GUV-er, mens andre steder i samme dråpe kan det dannes ingen eller få GUV-er. Dannelsen av GUV-er via LGT-agaroseassistert hevelse resulterer i en rekke GUV-størrelser, typisk fra noen få mikrometer til mer enn 50 μm.

Figure 6
Figur 6: DIC-bilder av proteoGUV-er dannet av gelassistert hevelse. Skalastang = 25 μm. Forkortelser: DIC = differensiell interferenskontrast; GUV-er = gigantiske-unilammellære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

GUV-ene høstes og fanges i en β-kaseinpassivert PDMS-basert mikrofluidisk enhet (figur 7). Enheten er utformet på en måte som gjør at mange vesikler kan fanges og analyseres i et enkelt eksperiment, og enheten brukes til å kontrollere det ytre miljøet (strømningshastighet, buffersammensetning, etc.) 34. Selv når utbyttet av proteo-GUV-er er lavt, gjør den konstante strømmen av GUV-er gjennom mikrofluidbrikken det mulig å samle opp mange vesikler. Når nok GUV-er er fanget, vaskes systemet med en osmotisk balansert buffer for å fjerne eksterne komponenter som løselige proteiner, små molekyler og fluorescerende sonder. Vaskebufferen erstattes deretter av en substratløsning med lik osmolalitet som inneholder 50 mM KPi (pH 7,0), varierende mengder glukose (for å justere osmolaliteten) og substrater som 10 mM L-arginin. Et tidsserieeksperiment gjøres på flere feller av mikrofluidikkbrikken og bilder tas hvert 90. Videre tas et lysfeltbilde på hvert tidspunkt. Forholdet mellom utslippsintensitetene etter eksitasjon ved 488 og 405 nm er et mål på ADP/ATP-forholdet i vesiklene.

Figure 7
Figur 7: Fangst av vesikler med mikrofluidisk brikke. (A) Fangst av vesiklene, ledsaget av evnen til å kontrollere det ytre miljøet og strømningshastigheten. (B) ProteoGUV-er fanget i en mikrofluidisk enhet og eksitert med en 405 nm laser (grønn) og 488 laser (rød). Utslipp for begge kanaler måles ved >500 nm. Lysfeltbildet gjør det mulig å visualisere vesiklene uten fluorescens. Skalastang = 25 μm. Forkortelse: GUVs = kjempe-unilamellære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer en protokoll for syntese av (membran)protein som inneholder lipidvesikler i submikrometerstørrelse (proteoGUL), og konvertering av proteoLÚVer til gigantiske unilamellære vesikler (proteoGUV). Protokollen bør gjelde for rekonstituering av andre membranproteiner 13,19,30,40 og innkapsling av andre metabolske nettverk enn L-arginin-nedbrytningen og glyserol-3-fosfatsynteseveiene presentert her.

Rekonstitueringen av membranproteiner i liposomer gir vanligvis en tilfeldig orientering av proteinene i lipidmembranen. For ArcD og GLPT spiller orienteringen ingen rolle, fordi proteinene fungerer toveis og de oppløste stoffene beveger seg avhengig av tegnet på det totale elektrokjemiske potensialet. For proteiner som fungerer i én retning, vil halvparten av molekylene ikke være tilgjengelige for aktivitet når orienteringen er 50/50.

Ekstruderingen av vesikler gjennom et polykarbonatfilter innsnevrer størrelsesfordelingen, og vesiklene blir mer homogene jo mindre porestørrelsen på filtrene er. Mindre vesikler kommer imidlertid på bekostning av å ha et mindre volum og dermed et svært lite antall proteiner (enzymer, membranproteiner) per vesikkel. For å minimere fraksjonen av LUV-er som mangler en eller flere komponenter, kan konsentrasjonen av proteinene justeres som vist i figur 3A,B, men med svært små vesikler er stokastiske effekter uunngåelige.

Den gelassisterte hevelsesmetoden er avhengig av avsetning av sonikerte vesikler (SUV-er) på en tørket agaroseoverflate. Under tørkeprosessen dannes en konsentrasjonsgradient av vesikler og lipidkonsentrasjonen er den høyeste i periferien av stedet. Dette skyldes et fenomen kjent som kaffeflekkeffekten41,42. Som et resultat inneholder bare et lite område på stedet en konsentrasjon av lipider som er egnet for GUV-dannelse. Sirkulære ujevnt konsentrerte lipidflekker resulterer i store ubrukte områder som ikke er tilgjengelige for vesikkelfusjon; derfor blir effektiviteten til GUV-dannelse lav i denne tilnærmingen. For å øke utbyttet av GUV-er, bør man sikte på en jevn lipidavsetning, som kan oppnås ved å spinne belegg42 eller utnytte kaffeflekkeffekten41.

Ytterligere merknader om protokollen:

Det bør utvises forsiktighet med at flere membranproteiner (>10) rekonstitueres i gjennomsnitt per vesikkel for å unngå stokastiske effekter. Unngå derfor lipid-til-protein-forhold høyere enn 400:1 vekt/vekt. En tilfeldig orientering antas for de fleste proteiner.

Ideelt sett er volumet av totale membranproteiner så lite som mulig og overstiger uansett ikke 10-20% av liposomvolumet. Tilsetning av større volumer vil introdusere mer vaskemiddel, og flertallet av forhåndsformede liposomer kan lysere, noe som kan ha en negativ effekt på rekonstitueringseffektiviteten.

Pre-ekvilibrering av ekstruderen med passende løsning er viktig for å unngå fortynning av komponentene under innkapslingen. Ideelt sett bør preekvibrasjonsløsningen også inneholde de oppløselige enzymene, men å inkludere enzymer kan være for kostbart på grunn av det relativt store volumet som trengs for pre-likevekt av ekstruderen. Derfor utelater vi vanligvis disse komponentene og aksepterer en 5% fortynning av enzymene.

Ionoforer bør tilsettes blandingene som inneholder proteoliposomer fordi molekylene er svært hydrofobe og kan adsorbere til overflater hvis vesikler ikke er tilstede. Det må utvises forsiktighet for at volumet av tilsatt oppløsningsvæske er lavt (<1 % av totalt reaksjonsvolum). Kontroller gjøres for å verifisere at løsningsmidlene ikke påvirker de metabolske nettverkene i vesiklene. Ionoforkonsentrasjoner på ca. 1 μM er generelt trygge for totale lipidkonsentrasjoner på ~3 mg/ml.

Det bør utvises forsiktighet for å tørke dråpene grundig. Hvis dråpene ikke er tørre nok, er GUV-dannelsen mindre effektiv ettersom lipider vil danne lipidaggregater og MLV-er kan dannes når hevelsesløsningen tilsettes.

Glukose brukes til å matche osmolariteten til det ytre til det indre mediet; sistnevnte inneholder sukrose i stedet for glukose for å øke tettheten av vesiklene og dermed lette sedimenteringen av GUV-ene. Dessuten forbedrer glukose i det ytre miljøet fasekontrasten, noe som gjør vesikkelen lettere synlig.

Stokastiske effekter er mye mindre av et problem med GUV-er; Men her kan overflate-til-volum-forholdet bli uakseptabelt lavt slik at antall membranproteiner (f.eks. transportører) blir begrensende for det interne metabolske nettverket. Metoden beskrevet i denne protokollen tillater ikke presis kontroll over størrelsen på proteoGUV-ene, men flertallet faller i størrelsesområdet 5-50 μm.

Avslutningsvis gir arbeidet som presenteres her en omfattende oversikt over membranproteinrekonstituering og enzyminnkapsling i lipidvesikler av varierende størrelse. Vi demonstrerer konstruksjonen av funksjonelle vesikler for syntese av ATP og byggesteiner fra enkle forløpere som aminosyrer og glyserol. Rekonstituering av membranproteiner i GUV-er er fortsatt utfordrende, men de her presenterte protokollene baner vei for videre utvikling innen nedenfra-og-opp syntetisk biologiforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Aditya Iyer for kloningen av pBAD-PercevalHR-genet og Gea Schuurman-Wolters for å hjelpe til med proteinproduksjon og rensing. Forskningen ble finansiert av NWOs gravitasjonsprogram "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Tags

Metabolske nettverk ute av likevekt membranproteinrekonstituering store unilamellære vesikler (UV) gigantiske unilamellære vesikler (GUV) bioreaktorer fluorescensbaserte sensorer enzyminnkapsling metabolittinnkapsling
Konstruksjon av metabolske nettverk utenfor likevekt i vesikler i nano- og mikrometerstørrelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, … More

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter