Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion
Summary
In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.
Abstract
Die Regulation der zellulären Adhäsion an die extrazelluläre Matrix (ECM) ist von wesentlicher Bedeutung für die Zell-Migration und ECM Umbau. Fokalen Adhäsionen sind makromolekulare Baugruppen, die Kopplung der kontraktilen F-Aktin-Zytoskelett der ECM. Diese Verbindung ermöglicht die Übertragung von intrazellulären mechanischen Kräfte durch die Zellmembran mit dem darunterliegenden Substrat. Neuere Arbeiten haben gezeigt, die mechanischen Eigenschaften der ECM regulieren fokale Adhäsion und F-Aktin-Morphologie sowie zahlreiche physiologische Prozesse, einschließlich der Zelldifferenzierung, Division, Proliferation und Migration. So hat der Einsatz von Zellkultursubstraten zu einem immer vorherrschende Methode zur präzisen Steuerung und modulieren ECM mechanischen Eigenschaften.
Zur Quantifizierung Zugkräfte an fokalen Adhäsionen in einer adhärenten Zelle, entsprechen Substraten in Verbindung mit hochauflösenden Bildgebung und rechnergestützte Techniken in einem Verfahren genannt Traction Force Mikroskopie (TFM) verwendet. Diese Technik beruht auf Messungen der lokalen Größe und Richtung der Substrat Verformungen durch zelluläre Kontraktion induziert. In Kombination mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie von fluoreszenzmarkierten Proteinen ist es möglich, Zytoskelett-Organisation und Umbau mit Zugkräften zu korrelieren.
Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Versuchsprotokoll für die Herstellung von zweidimensionalen, konforme Matrizen für die Zwecke der Schaffung einer Zellkultur Substrat mit einem gut charakterisierten, abstimmbaren mechanische Steifigkeit, die für die Messung zellulärer Kontraktion ist. Diese Protokolle umfassen die Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogele, Beschichtung von ECM-Proteine auf solche Gele, Plattieren Zellen auf Gele und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie mit einem Perfusionskammer. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, die zeigen Lage und das Ausmaß der zellulären Kräfte mit angeführt TFM-Protokolle.
Protocol
Discussion
Das hier beschriebene Verfahren für den Aufbau einer Zugkraft-Mikroskopie (TFM) Experiment, zusammen mit der Umsetzung der Computational Tracking-Routinen (Sabass et al., 2008), ermöglicht die Quantifizierung von zellulären Kräfte mit Mikrometer-Skala räumlicher Auflösung. Zur Optimierung der experimentellen Protokoll, ist es entscheidend, eine reine und gleichmäßige Gelsubstrat mit gleichmäßigen Beschichtung von ECM-Liganden zu bilden. Wir diskutieren mögliche Fallstricke unter:
<p class="jove_s…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Labor von Ulrich Schwarz für Computational Tracking-Software in die Quantifizierung von zellulären Zugkräfte (Sabass et al., 2008) verwendet. Diese Arbeit wurde durch ein Burroughs Wellcome Career Award und NIH Director der Pioneer Award (DP10D00354) zu ML Gardel und Medical Scientist National Research Service Award (5 T32 GM07281) auf SP Winter unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
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