Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular
Summary
In questo video, dimostriamo le tecniche sperimentali utilizzate per fabbricare compatibile, della matrice extracellulare (ECM) substrati rivestiti adatto per colture cellulari e che sono suscettibili di microscopia a forza di trazione e di osservare gli effetti di rigidità ECM sul comportamento delle cellule.
Abstract
Il regolamento di adesione cellulare alla matrice extracellulare (ECM) è essenziale per la migrazione cellulare e rimodellamento ECM. Adesioni focali sono le assemblee macromolecolari che la coppia di F-contrattili actina del citoscheletro per l'ECM. Questo collegamento consente la trasmissione delle forze meccaniche intracellulare attraverso la membrana cellulare al supporto sottostante. Studi recenti hanno dimostrato le proprietà meccaniche della ECM regolare adesione focale e F-actina morfologia oltre a numerosi processi fisiologici, quali la differenziazione cellulare, la divisione, la proliferazione e la migrazione. Pertanto, l'uso di substrati di coltura cellulare è diventato un metodo sempre più diffuso per controllare con precisione e modulare le proprietà meccaniche ECM.
Per quantificare le forze di trazione in adesioni focali in una cella aderente, supporti compatibili sono utilizzati in combinazione con imaging ad alta risoluzione e tecniche computazionali in un microscopio chiamato metodo della forza di trazione (TFM). Questa tecnica si basa sulla misurazione della magnitudo locale e la direzione del substrato deformazioni indotte dalla contrazione cellulare. In combinazione con alta risoluzione microscopia a fluorescenza di proteine fluorescenti tag, è possibile correlare l'organizzazione del citoscheletro e rimodellamento con le forze di trazione.
Qui vi presentiamo un piano sperimentale dettagliato per la preparazione di due dimensioni, matrici compatibili al fine di creare un substrato di coltura cellulare con un ben caratterizzato, sintonizzabile rigidità meccanica, che è adatto per misurare la contrazione cellulare. Questi protocolli includono la realizzazione di idrogel di poliacrilamide, rivestimento di proteine ECM su gel di tali cellule placcatura in gel, e ad alta risoluzione, microscopia confocale utilizzando una camera di perfusione. Inoltre, mettiamo a disposizione un campione rappresentativo di dati che dimostrino posizione e la grandezza delle forze cellulare utilizzando protocolli citato TFM.
Protocol
Discussion
La procedura descritta qui per la configurazione di un microscopio a forza di trazione (TFM) sperimentare, insieme con l'implementazione delle routine di tracciamento computazionale (Sabass et al., 2008), consente per la quantificazione delle forze cellulare con micron scala risoluzione spaziale. Per ottimizzare il protocollo sperimentale, è fondamentale per formare un substrato di gel puro ed uniforme con rivestimento uniforme di legante ECM. Discutiamo potenziali insidie di seguito:
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il laboratorio di Ulrich Schwarz per il software di monitoraggio di calcolo utilizzati nella quantificazione delle forze di trazione cellulare (Sabass et al., 2008). Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di carriera Burroughs Wellcome e Pioneer Award NIH direttore (DP10D00354) per ML Gardel e Medical Scientist Premio Nazionale delle Ricerche Servizio (5 T32 GM07281) a SP Winter.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
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