이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
세포외 매트릭스 (ECM)에 세포 부착의 조절은 세포 마이 그 레이션 및 ECM의 리모델링을 위해 필수적입니다. 초점 adhesions은 macromolecular 어셈블리 그 부부 ECM에 수축성 F - 굴지의 cytoskeleton을하고 있습니다. 이 연결은 세포막에 걸쳐 기본 기판에 세포 기계 병력의 전송을 허용합니다. 최근 작품은 ECM의 기계적 성질은 초점 접착력 및 F - 굴지의 형태뿐만 아니라, 세포 분화, 분열, 증식 및 마이 그 레이션 등 다양한 생리 과정을 조절 표시하고 있습니다. 따라서, 세포 배양 기판의 사용이 정확하게 제어 및 ECM 기계적 특성을 조절하기 위해 점점 더 널리 사용 방법이되었습니다.
자기편 세포에 초점 adhesions의 견인 세력을 계량하기 위해 준수 기판은 고해상도 이미지와 방법 칭했다 견인 힘 현미경 (TFM)에서 전산 기술과 함께 사용됩니다. 이 기술은 세포의 수축에 의해 유도 기판 deformations의 로컬 크기와 방향의 측정에 의존하고 있습니다. 찬란 태그 단백질의 고해상도 형광 현미경와 함께, 그것은 견인 세력과 cytoskeletal 조직 및 개조를 상호 연관시킬 수 있습니다.
여기 우리는 세포 수축 측정에 적합합니다 잘 특징, 조정할 수있는 기계 강성과 세포 배양 기판을 만들 목적으로 2 차원, 호환 매트릭스의 준비에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 polyacrylamide의 hydrogels의 제조 등 젤에서 ECM의 단백질 코팅, 젤에 도금 세포 및 재관류 챔버를 사용하여 고해상도 공촛점 현미경을 포함합니다. 또한, 우리는 인용 TFM 프로토콜을 사용하여 세포 세력의 위치와 크기를 보여주는 데이터의 대표 샘플을 제공합니다.
프로토콜
1. coverslip 표면을 활성화
- Coverslips는 (# 1.5, 22x40 ㎜) 먼지를 청소하고 제거하는 이전에 설명한 프로토콜 (워터맨 - 스톨러, 1998)에 비누와 에탄올 세척 일련의를 사용하여 청소합니다.
- 스테인레스 스틸 홀더 랙에 장소 coverslips은 같은 그 coverslips는 분리 간격과 감동을하지 않습니다.
- 화학 펌 후드 (nitrile 장갑 및 권장 고글)에서 정사각형 유리 접시를 (~ 350ml 볼륨) 작성 (2ml 실란 / 100 ML 이소프로판올) 2 %의 최종 농도에 대한 이소프로판올 3 - aminopropyltrimethoxysilane 전체 강도를 희석. 플라스틱과 반응으로 인해, 이소프로판올 3 - aminopropyltrimethoxysilane 적용할 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
- 10 분이 솔루션에 1.2에서 완전히 젖어 coverslips 부드럽게 퓸 후드에 저어 접시에 감동하면서.
- ddH 2 O (물 4 교류)에 immersing로 coverslips 씻으십시오. 10 분 교반과 함께 최종 교환 시간을 몸을 담글 수 있습니다. 아미노 실란이 포함된 솔루션은 유해 폐기물로 처리되어야합니다.
- 따뜻한 온도에서 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
절차는 전산 추적 루틴 (Sabass 외., 2008)의 구현과 함께, 견인 힘 현미경 (TFM) 실험의 설정을 위해 여기에서 설명한, 마이크론 규모의 공간 해상도 세포 세력의 부량 수 있도록합니다. 실험 프로토콜을 최적화하기 위해서는 ECM의 리간드의 균일한 코팅을 가진 순수하고 균일한 겔 기판을 형성하는 것이 중요합니다. 우리는 아래의 잠재적인 함정을 논의 :
비 균일한 겔 표면 또는 눈물 :
우리의 경험에서, 멋진 유니폼 젤을 형성하는 중요한 나타나는 몇 가지 단계가 있습니다. 귀하의 겔 표면 안에 어두운 구멍을 가지고 나타나는 경우에 대한 중합에 젤에 대한 고르지 소수성 표면을 형성 초과 비 - X의 방울이 완전히 유리 슬라이드에서 제거되지 않은 가능성이 높습니다. 또한, 우리는 매우 부드러운 젤에 대한 (<100 PA), 겔 표면으로 인해 제약 coverslip 표면에 점착 성의 PAA 젤의 팽창에 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 셀룰러 견인 세력 (Sabass 외., 2008)의 부량에 사용되는 전산 추적 소프트웨어 울리히 슈바르츠의 실험실을 감사드립니다. 이 작품은 버로우즈 웰컴 경력 수상과 ML Gardel 의료 과학 국립 연구소 서비스 어워드 (5 T32 GM07281) SP 겨울에하는 NIH 원장의 파이 오니아 수상 (DP10D00354)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | |
| 40% 아크릴아마이드(Acrylamide) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% 비스-아크릴아마이드(Bis-acrylamide) | Fisher Scientific | BP1404 | |
| TEMED | Fisher Scientific | BP 150-20 | |
| 과황산암모늄(Ammonium persulfate) | Fisher Scientific | BP179 | |
| 40nm 형광 미세구체(fluorescent micro-spheres) | Invitrogen | F8789 | |
| Sulfo-SANPAH | Pierce, Thermo Scientific | 22589 | |
| 공초점 이미징 챔버(Confocal imaging chamber, RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | |
| 커버슬립 스피너(Coverslip spinner) | 자체 제작 | NA | |
| 자외선 램프 CL1000(Ultraviolet lamp CL1000) | UVP Inc. | 95-0228-01 | |
| 스테인리스 스틸 랙(Stainless steel rack) | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | |
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | |
| 하이드라진 하이드레이트(Hydrazine hydrate) | Sigma-Aldrich | 225819 | |
| 메타-과요오드산나트륨(Sodium meta-periodate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20504 | |
| 이소프로판올(Isopropanol) | Fisher Scientific | A416-4 | |
| 피브로넥틴(Fibronectin) | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| 콜라겐(Collagen) | BD Biosciences | 354236 | |
| 커버슬립(Coverslips, #1.5) | Corning | 2940‐224 | |
| 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde) | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | |
| 아세트산(Acetic Acid) | Acros Organics | 64-19-7 |
참고문헌
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
