Подготовка жалобы матриц для Количественная Сотовая Сокращение
Summary
В этом видео мы продемонстрируем экспериментальные методы, используемые для изготовления совместимый, внеклеточного матрикса (ECM), покрытых субстратов пригодны для культуры клеток, и которые поддаются тяги силовой микроскопии и наблюдая последствия жесткости ECM на поведение клеток.
Abstract
Регуляции клеточной адгезии к внеклеточного матрикса (ECM), имеет важное значение для миграции клеток и ECM ремоделирования. Фокусное спайки макромолекулярных сборок, пару сократительной F-актин цитоскелета в ECM. Эта связь позволяет передачу внутриклеточных механическими силами через клеточную мембрану к основной субстрат. Последние исследования показали, механические свойства ECM регулировать координационный адгезии и F-актин морфологии, а также многочисленные физиологические процессы, в том числе дифференцировки клеток, деление, пролиферацию и миграцию. Таким образом, использование подложки клеточной культуры становится все более распространенным методом точно контролировать и модулировать ECM механические свойства.
Для количественной оценки тяговых усилий в фокальных спайки в приверженцем клетки, совместимые подложки используются в сочетании с высокой разрешающей способностью и вычислительной техники в метод называется микроскопии тяговое усилие (TFM). Этот метод основан на измерении местных величину и направление деформации подложки индуцированных сотовой сокращения. В сочетании с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии флуоресцентно меткой белков, можно соотнести цитоскелета организации и ремоделирования с тягой сил.
Здесь мы представляем подробный экспериментальный протокол для подготовки двумерным, совместимый матриц для того, чтобы создать подложку культуре клеток с хорошо характеризуется, перестраиваемый механическую жесткость, которая подходит для измерения сотовой сокращения. Эти протоколы включают изготовление полиакриламидных гидрогелей, покрытие белков ECM на таких гелей, покрытие клеток на гели и высоким разрешением конфокальной микроскопии с использованием перфузионной камере. Кроме того, мы предоставляем репрезентативной выборки данных, свидетельствующих о местоположении и величине сотового сил использованием привел TFM протоколов.
Protocol
Discussion
Процедура, описанная здесь для настройки микроскопии тяговое усилие (TFM) эксперимента, а также реализация вычислительной процедуры отслеживания (Sabass и соавт., 2008), дает возможность количественного клеточного силы с микронных пространственным разрешением. Для оптимизации эксперим…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим лаборатории Ульриха Шварца для вычислительных отслеживания программного обеспечения, используемых в количественной оценке сотовых силы тяги (Sabass и соавт., 2008). Эта работа была поддержана Карьера Burroughs Wellcome премии и премии Pioneer NIH директора (DP10D00354) для ML Гардель и научный медицинский Национальный исследовательский Service Award (5 T32 GM07281) для зимних SP.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. e. w. m. a. n., Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. i. s. c. h. e. r. Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses. Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).
- Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).
- Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading. Biophys J. 89, 676-689 (2005).
- Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophys J. 94, 207-220 (2008).
- Yeung, T. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).
