Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular
Summary
Neste vídeo, demonstramos as técnicas experimentais usadas para fabricar compliant, matriz extracelular (ECM) substratos revestidos adequado para cultura de células, e que são passíveis de microscopia de força de tração e observando os efeitos da rigidez ECM no comportamento de células.
Abstract
A regulação da adesão celular à matriz extracelular (ECM) é essencial para a migração celular e remodelação ECM. Aderências focais são conjuntos macromoleculares que o casal o citoesqueleto de actina F-contrátil ao ECM. Esta conexão permite a transmissão de forças mecânicas intracelular através da membrana celular ao substrato subjacente. Trabalho recente mostrou as propriedades mecânicas do ECM regular de adesão focal e F-actina morfologia, bem como numerosos processos fisiológicos, incluindo a diferenciação celular, divisão, proliferação e migração. Assim, o uso de substratos de cultura de células tem se tornado um método cada vez mais prevalente para controlar com precisão e modular as propriedades mecânicas ECM.
Para quantificar as forças de tração em aderências focal em uma célula aderente, compatível substratos são usados em conjunto com imagens de alta resolução e técnicas computacionais em um método denominado microscopia de força de tração (TFM). Esta técnica se baseia em medições da magnitude local e direção de deformações do substrato induzida pela contração celular. Em combinação com alta resolução da microscopia de fluorescência de proteínas fluorescentes marcados, é possível correlacionar organização do citoesqueleto e remodelação com as forças de tração.
Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para a preparação de duas dimensões, matrizes compatíveis com a finalidade de criar um substrato de cultura celular com um bem caracterizados, rigidez ajustável mecânica, que é adequado para medir a contração celular. Estes protocolos incluem a fabricação de hidrogéis de poliacrilamida, revestimento de proteínas em gel de ECM como, células de revestimento em gel, e de alta resolução da microscopia confocal usando uma câmara de perfusão. Além disso, oferecemos uma amostra representativa de dados demonstrando localização e magnitude das forças de celulares utilizando protocolos citados TFM.
Protocol
Discussion
O procedimento descrito aqui para a instalação de uma microscopia de força de tração (TFM) experimento, juntamente com a implementação de rotinas de monitoramento computacional (Sabass et al., 2008), permite a quantificação das forças celulares com resolução de micro-escala espacial. Para otimizar o protocolo experimental, é fundamental para formar um substrato de gel puro e uniforme, com revestimento uniforme do ligante ECM. Discutimos potenciais armadilhas abaixo:
Não u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao laboratório de Ulrich Schwarz para software de monitoramento computacional usado em quantificação das forças de tração celular (Sabass et al., 2008). Este trabalho foi financiado por um Prémio Carreira Burroughs Wellcome e Prêmio NIH Director da Pioneer (DP10D00354) para ML Gardel e cientista médico Prêmio Nacional de Serviço de Investigação (5 GM07281 T32) para inverno SP.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. e. w. m. a. n., Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. i. s. c. h. e. r. Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses. Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).
- Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).
- Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading. Biophys J. 89, 676-689 (2005).
- Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophys J. 94, 207-220 (2008).
- Yeung, T. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).
