Summary

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Published: December 05, 2011
doi:

Summary

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Abstract

Cardiale immuuncellen worden steeds belangstelling voor de rollen die zij spelen in de pathologische remodeling in veel hartaandoeningen 1-5 Deze immuuncellen, die mestcellen, T-cellen en macrofagen bevatten;. Bewaren en laat een verscheidenheid van biologisch actieve mediators zoals cytokines en proteases zoals tryptase. 6-8 Deze bemiddelaars is aangetoond dat de belangrijkste spelers in de extracellulaire matrix metabolisme worden door het activeren van matrix metalloproteinases of het veroorzaken van collageen accumulatie door het moduleren van de cardiale fibroblasten 'functie. 9-11 echter beschikbare technieken voor het isoleren van het hart immune cellen is problematisch omdat ze bacterieel collagenase om de myocardweefsel verteren. Deze techniek zorgt voor de activatie van het immuunsysteem cellen en dus een verlies van functie. Bijvoorbeeld, cardiale mestcellen worden aanzienlijk minder reageren op stoffen die degranulatie kunnen veroorzaken. Daarom 12, hebben we een techniek ontwikkeld die het mogelijk maakt voor tHij isolatie van functionele hart immune cellen, die zou leiden tot een beter begrip van de rol van deze cellen in hart-en vaatziekten. 13, 14

Deze methode vereist een vertrouwdheid met de anatomische locatie van zwaardvormig de rat het proces, oksel en gebogen ligament, en hartzakje van het hart. Deze monumenten zijn belangrijk voor het succes van de procedure te verhogen en een hogere opbrengst van de cardiale immune cellen te verzekeren. Deze geïsoleerde hart immune cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de karakterisering van functionaliteit, fenotype, volwassenheid en co-cultuur experimenten met andere hartcellen tot een beter begrip van hun interacties te krijgen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Balance Hanks 'Salt Solution (HBSS) Autoclaaf een L glazen beker, 1000 ml maatcilinder, en roer bar. Los het poeder HBSS oplossing in de geautoclaveerde een L glazen beker op de 900 ml maatstreep met dubbel gedestilleerd water. Meng HBSS oplossing met 3,4 g van Hepes Na + zout en breng de pH op een waarde tussen 7,35-7,41 met behulp van geconcentreerde HCl of NaOH. Zodra de gewenste pH is bereikt en blijft stabiel, voeg 5 g runder serum albumine aan de…

Discussion

Deze methode van isoleren van cardiale immuuncellen maakt de analyse van hun functie, fenotype, en volwassenheid zonder de ongewenste activering die normaal gesproken optreedt tijdens een traditionele enzymatische vertering isolatie techniek. De gemiddelde totale aantal cellen verkregen met deze techniek is ongeveer 400.000 per rat hart, en differentiële kleuring en flowcytometrie-analyse van deze cellen geeft aan gemengde populatie van T-lymfocyten (~ 70%), macrofagen (~ 12%) en mast cellen met het gebruik van deze te…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een UNCF-Merck Graduate Wetenschappelijk Onderzoek Proefschrift Fellowship (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute beurzen RO1-HL-62228 (JSJ) en RO1-HL-073990 (JSJ).

Materials

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
Hanks’ Balanced Salt Sigma H4891 One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt
Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt
Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic Gibco 15240-062  
HEPES Sigma H3784  
Bovine Serum Albumin Sigma A3912  
250 mL Nalogene Filter Bottle Thermoscientific 157-0020  
12 N HCL Fisher Scientific CAS 7647-01-0 For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH Fisher Scientific SC267 For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water      

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
3-O Suture Silk Braided Ethicon Products SA64H  
Small Animal Ventilator CWE Incorporated SAR-830 Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle BD Biosciences 305199 Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter Baxter 2N111 Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe Fisher Scientific 14-823-16B  
15 mL Falcon Tubes BD Biosciences 352097  
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge Fisher Scientific 75-004-377 Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone Thermoscientific S300030.02  
Hemocytometer Hausser Scientific HS-LB-1483  

References

  1. Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
  2. Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
  3. Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
  4. Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
  5. Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
  6. Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
  7. Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
  8. Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
  9. Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
  10. Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
  11. Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
  12. Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
  13. Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
  14. Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).

Play Video

Cite This Article
McLarty, J. L., Meléndez, G. C., Spencer, W. J., Levick, S. P., Brower, G. L., Janicki, J. S. Isolation of Functional Cardiac Immune Cells. J. Vis. Exp. (58), e3020, doi:10.3791/3020 (2011).

View Video