Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

Summary

Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.

Abstract

Die Sinnesorgane des Huhns Innenohr werden durch die peripheren Prozesse statoacoustic Ganglion (SAG) Neuronen innerviert. Sinnesorgan Innervation beruht auf einer Kombination von Axon Führung Signale ¹ und Überlebensfaktoren ² entlang der Flugbahn der wachsenden Axone und / oder in ihren Sinnesorgan Ziele entfernt. Zum Beispiel erzeugt funktionelle Störungen mit einem klassischen Axon Führung Signalweg, Semaphorin-Neuropilin, Fehlleitung von otic Axone ^3. Auch mehrere Wachstumsfaktoren in den sensorischen Ziele des Innenohrs, darunter Neurotrophin-3 (NT-3) und Brain Derived neurotrophen Faktor (BDNF), ausgedrückt in transgene Tiere manipuliert worden, was wiederum zu der SAG Axone ⁴ Fehlleitung. Dieselben Moleküle fördern sowohl das Überleben und die Neuritenwachstum chick SAG Neuronen in vitro ^5,6.

Hier beschreiben wir und zeigen die In-vitro-Methode, die wir derzeit usingen, um die Reaktionsfähigkeit von chick SAG Neuriten, lösliche Proteine, einschließlich bekannter Morphogene wie die Wnts, sowie Wachstumsfaktoren, die wichtig für die Förderung der SAG Neuritenwachstum und Neuron Überleben zu testen. Mit diesem Modellsystem, hoffen wir Rückschlüsse auf die Effekte, die sezernierte Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum ausüben kann zeichnen.

SAG Explantate an embryonalen Tag 4 (E4) präpariert und kultiviert im dreidimensionalen Kollagen-Gelen unter serumfreien Bedingungen für 24 Stunden. Erstens ist Neuriten Reaktionsfähigkeit durch Kultivierung Explantate mit Protein-ergänzt Medium getestet. Dann, um zu fragen, ob Punktquellen von sekretierten Liganden können direktionale Effekte auf Neuritenwachstum haben, sind Explantate mit Protein-beschichteten Beads co-kultiviert und untersucht für die Fähigkeit der Raupe vor Ort zu fördern oder hemmen Auswuchs. Wir berücksichtigen auch eine Demonstration der Dissektion (modifizierten Protokoll ⁷⁾ und die Kultur der E6 Rückenmark Explantate. Wirroutinemäßig Rückenmark Explantate auf Bioaktivität der Proteine ​​und Protein-getränkte Perlen zu bestätigen, und um zu überprüfen Spezies Kreuzreaktivität mit chick Gewebe, unter den gleichen Kulturbedingungen wie SAG Explantate. Diese in-vitro-Assays sind für das schnelle Screening nach Molekülen, die trophische (Überlebensrate) oder tropic (Richt-) Wirkungen auf SAG Neuronen ausüben, insbesondere vor der Durchführung von Studien in vivo bequem. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Prüfung von einzelnen Molekülen unter serumfreien Bedingungen mit hoher Neuron Überleben ^8.

Protocol

Rezepte

Küken Ringers

7,2 g	NaCl
0,23 g	CaCl 2 + 2H 2 O
0,37 g	KCl
0,115 g	Na 2 HPO 4
900 ml	Water (Tissue culture grade)

Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4. Bringen Endvolumen von 1000 ml mit Wasser.

10X PBS

40 g	NaCl
1 g	KCl
7 g	Na 2 HPO 4
1,2 g	KH 2 PO 4
450 ml	DEPC-Wasser

Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4. Bringen endgültigenVolumen auf 500 ml mit Wasser. Arbeitskonzentration (1X) wird durch Verdünnen von 1 Teil 10X Lager mit 9 Teilen von Gewebe-Kultur-Wasser, wie es mit einem Millipore UV-Bestrahlung, um Wasser mit 18 MOhm-cm Leitfähigkeit erzeugen gewonnen wird.

SAG Explantation halten Medium

• DMEM/F12 mit L-Glutamin, 10 mM Hepes
• 10% Insulin, Übertragen, Selenium (ITS +1)
• 1% Pen-Strep

Explantation Kulturmedium

• SAG Explantation halten Medium
• 10 ng / ml Neurotrophin-3 (NT-3)
• 10 ng / ml ciliary neurotrophen Faktors (CNTF)

Rückenmark Dissektion und Halten Medium

• L-15
• 10% fötalem Kälberserum
• 1% Pen-Strep

Inkubieren Eier bei 37-38 ° C. Sterilisieren Sezieren Werkzeuge und Sylgard Sezieren Gericht in 70% Ethanol. Dissecting Geschirr und Werkzeuge können auch UV sterilisiert Nacht.

1. Legen Sie Perlen in einem Mikroröhrchen mit 1 ml steriler PBS, mischen, und warten Sie die Perlen auf den Boden des Röhrchens zu begleichen.
2. Waschen Sie die Kugeln mehrmals durch das Entfernen der Überstand nach den Perlen niedergelassen haben und resuspendieren in PBS.
3. Inkubieren Sie die Perlen in gereinigtes Protein (verdünnt in PBS) oder PBS allein (Control) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Spülen Sie die Perlen in PBS und an einem 24-Well-Platte mit 1 ml PBS, bis in Kollagen platziert.

2. Statoacoustic Ganglion Dissektion

1. Auf E4 entfernen der Embryo aus dem Ei und legen Sie sie in einer Schale mit Küken Ringer-Lösung zu embryonalen Membranen zu entfernen.
2. Setzen Sie den Embryo in einem Sylgard © gesäumt Petrischale mit kaltem HBSS und die Position des Embryos auf die Seite mit dem otic Vesikel nach oben gefüllt. Pin des Embryos in die Schale mit Sezieren Pins.
3. Mit zwei Sezieren Stifte, einen horizontalen Schnitt durch die Haut sofort ventral derKanal Beutel, ungefähr dort, wo es erfüllt die Ductus cochlearis. Machen Sie einen vertikalen Schnitt vorderen und hinteren der SAG. Verwenden einer Pinzette oder einem Seziertisch pin zu heben und entfernen Sie die Klappe der Haut durch die drei Schnitte begrenzt.

   Hinweis: Die SAG ist in der anteroventral Rand des otocyst, etwa auf halbem Weg zwischen der dorsalen Tasche, die gut sichtbar mit Hellfeld Basis Beleuchtung und dem ventralen Ductus cochlearis, die ventromedial Projekte und wird von der Schlundbögen verdeckt. Der Ductus cochlearis verlängert so seine dorsoventrale Dimension wird schrittweise auf E4 Anstieg zwischen Hamburger-Hamilton Stufen 23-25 ​​September.

4. Ziehen Sie die otocyst nach dorsal um es aus der SAG zu trennen. Displace umgebende Gewebe der SAG mit Dissektion Pins und entfernen Sie vorsichtig die SAG aus dem Embryo mit Nr. 55 Pinzetten. Entfernen Sie große Stücke mesenchymale Gewebe und hervorstehende Nervenbündel aus der SAG.
5. Mit einem breit-Mund-Pipettenspitze, übertragen Sie die Explantation einer24-Well-Platte mit 0,5 ml SAG Explantation halten Medium. Keep Explantate auf Eis oder bei Raumtemperatur für bis zu 4 Stunden.

3. Rückenmark Dissektion

1. Entfernen Sie die E6 Embryo aus dem Ei und legen Sie sie in eine Schale mit Küken Ringerlösung. Entfernen Sie den Kopf und embryonalen Membranen.
2. Setzen Sie den Körper in einer Sylgard © Sezieren Schüssel mit kaltem Rückenmark Dissektion Medium. Position und Pin des Embryos "ventral down" und caudal mit Blick auf den Experimentator. Legen Sie sezieren Stifte durch die einzelnen Gliedmaßen und durch das vordere Ende.
3. Mit einer Pinzette und / oder sezieren Stifte, entfernen Sie vorsichtig Haut und Gewebe, bewegt sich in eine ventrale Richtung, bis der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks zu sehen ist.
4. Cut der dorsalen Mittellinie des Rückenmarks mit einer Zerlegung pin, in einer posterior nach anterior Richtung, entlang der gesamten Länge des Rückenmarks. Dadurch entsteht ein "offenes Buch", wie die linke und rechte Seite des Rückenmarks zu trennen.
5. Entfernen Sie das Rückenmark aus dem Körper, indem Sie die Schwanzflosse am weitesten Ende des Rückenmarks mit einer Pinzette und anheben und vom Experimentator. Beseitigung der verbleibenden DRG und der Hirnhäute.
6. Halten Sie das eine Ende des Rückenmark mit einer Pinzette (oder stecken Sie es in die Schale) und die Nutzung Vannas Schere entlang der ventralen Mittellinie geschnitten, um das Rückenmark zu halbieren.
7. Halten Sie das eine Ende des Explantat mit einer Pinzette, um das Gewebe zu immobilisieren und benutzen Vannas Schere, kleine Explantate (100-500 um in der Länge) entlang der Länge des Gewebes geschnitten. Die Bodenplatte kann als ein klares Verdickung des Gewebes an einer Explantation Kante erkannt werden.
8. Verwenden Sie einen Weithals-Pipettenspitze zu Explantate auf eine 24-Well-Platte übertragen mit 0,5 ml kalte Dissektion Medium. Keep Explantate auf Eis zu Gewebeviabilität, f zu erhaltenoder bis zu 4 Stunden.

4. Explantation Kultur mit gereinigten Proteinen zu Neuriten Reaktionstest

1. Bereiten Sie eine 1,5 mg / ml Kollagen-Lösung in einem 15 ml konischen Rohr, auf Eis, nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Überprüfen Sie die Kollagen-Lösung hat einen pH-Wert von 7-7,4 mit pH-Indikatorpapier. Den pH-Wert durch Zugabe von NaOH in 1 ul.
3. Transfer-Explantate auf eine 24-Well-Platte mit einem breiten Mund Pipettenspitze und saugen überschüssige Flüssigkeit. Mehrere Explantate können in einem gut kultiviert werden, sollte aber gelegt mindestens 500 pm voneinander entfernt sein von einander.
4. 0,5 ml Kollagen, die gut mit dem Explantat. Position der Explantation an der unteren Oberfläche des Brunnens. Achten Sie darauf, jede Kultur völlig einstellen, bevor Sie mit dem nächsten gut, weil das Kollagen beginnt bei Raumtemperatur polymerisieren.
5. Legen Sie die Kultur Platte auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 30-45 min, um das Kollagen zu polymerisieren. Wenn die Kollagen hat polymerisiertemrized es wird ein Gel ähnelt.
6. 0,5 ml warmen Explantation Kulturmedium entweder mit gereinigten Proteinen (verdünnt in PBS) oder PBS (Control) ergänzt und bei 37 ° C, 5% CO _2. Auswirkungen auf Neuritenwachstum sichtbar sein soll von 24 Stunden.

   HINWEIS: Wir haben das gleiche Protokoll zur Kultur SAG Explantate verwendet bis zu 42 Stunden.

5. Explantation Co-Kultur mit Protein-beschichteten Beads zu direktionale Neuritenwachstum Test

1. Beginnen Sie mit Explantation Kultur Schritte 4,1-4,4.
2. Mit einer Pipette, Transfer 1-5 Kügelchen aus PBS, die gut mit den Kollagen-Lösung und Explantation.
3. Verwenden einer Pinzette, um Perlen 50-500 um vom Rand der Explantation Position.
4. Legen Sie die Platte auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 30-45 min, um das Kollagen zu polymerisieren. Die Gewebe-oder Wulst kann sich verschoben, wie das Kollagen polymerisiert. Überprüfen Sie die Kulturen und neu positionieren das Gewebe und Perlen in den ersten 5 min.
5. Add 0,5 ml SAG Medien in jede Vertiefung und inkubieren für 24 Stunden.

6. Visualisierung von Neuriten durch Immunhistochemie

1. Spülen Kulturen in PBS und fixieren Sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 4% Paraformaldehyd in PBS.
2. Lassen Sie die Gele aus den Wänden der Vertiefungen durch Tracing um den Rand der Gele mit den abgerundeten Ende einer Teflon-micro Spachtel. Führen Sie die immunostain mit den Gelen in die Vertiefungen geben. Spülen Sie mehrmals in PBS.
3. Inkubieren in 0,5 ml Blocking-Lösung (10% Kälberserum, 0,1% Triton X-100, 0,1% Natriumazid in PBS) über Nacht bei 4 ° C.
4. Inkubieren in 0,5 ml primären Antikörper (Anti-β-Tubulin-Antikörper 1:500 verdünnt in Blockierungslösung) über Nacht bei 4 ° C.
5. Spülen Sie mehrmals in PBS. Inkubieren in 0,5 ml sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG _2b Antikörper verdünnt 1:500) über Nacht bei 4 ° C. Von diesem Schritt nach vorn, halten Platten in dunklen oder wickeln Sie sie in Folie, durch die Empfindlichkeit des LichtsSekundärantikörper.
6. Spülen Sie mehrmals in PBS und lagern bei 4 ° C in PBS bis zu einer Woche.

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse des Neuriten-fördernde Wirkung von gereinigtem NT-3 und NT-3-beschichteten Kügelchen auf E4 chick SAG Explantate. SAG Neuron Zellkörper und Neuriten wurden mit β-Tubulin immungefärbt und bebildert mit einem 10-fach Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop. Nach 24 Stunden in vitro, angezeigt SAG Explantate größere Neuritenwachstum in Gegenwart von 100 ng / ml gereinigtes humanes NT-3 auf dem Zellkulturmedium (1B) aufgenommen, im Vergleich zur Kontrollgruppe (1A). SAG Neuronen wurden mit Perlen eingeweicht in 100 ng / ml NT-3 zu zeigen, dass eine Punktquelle von NT-3 kann vor Ort zu fördern Neuritenwachstum co-kultiviert. Explantate angezeigt länger und dichter Neuritenwachstum auf der Seite desExplantation mit Blick auf den Wulst auf der gegenüberliegenden Seite (1D) im Vergleich und im Vergleich zu Kulturen mit Perlen in PBS (1C) getränkt Kontrolle. Maßstab = 200 um.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse des Neuriten-fördernde Wirkung von gereinigtem Wnt5a und Wnt5a-beschichteten Kügelchen auf E6 chick Rückenmark. Rückenmark Explantate wurden mit β-Tubulin immungefärbt und bebildert mit einem konfokalen Mikroskop. Nach 24 Stunden Wachstum in Gegenwart von gereinigtem Maus Wnt5a (400ng/ml), Neuritenwachstum von chick Rückenmark Explantate wurde erhöht (2B), die Kontrollen ohne Wnt5a (2A) kultiviert verglichen. Beads in 500 ng / ml Wnt5a eingeweicht, platziert 300-500 um von der Kante des Rückenmarks Explantate, ebenfalls gefördert Neuritenwachstum (2D) im Vergleich zu Kulturen (2C) zu steuern. Ähnliche Co-Kultur-Ergebnisse waren zuvor mit Wnt5a-exprimierenden Zellen ⁸ veröffentlicht. Maßstabsbalken = 200um.

Discussion

Wir stellen eine Methode zu sezieren und Kultur E4 und E6 SAG Rückenmark Explantate von chick, unter serumfreien Bedingungen. Dieses Verfahren wird derzeit in unserem Labor verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen sezernierten Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum zu studieren. Neue Aspekte dieses Protokolls sind die Verwendung eines serumfreien System zur Kultivierung von Explantaten und die Verwendung von Perlen in Wachstumsfaktoren getränkt, um Auswirkungen auf die SAG Neuritenwachstum zu studieren. Eine Wulst-Verfahren ähnlich wie bei uns für das Küken des Rückenmarks ¹⁰ beschrieben. Traditionell haben die Perlen in Studien mit klassischen Axon Führung Faktoren und Morphogene verwendet worden. Hier haben wir gezeigt, dass der Wulst-Test kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen der Neurotrophine (oder anderen Wachstumsfaktoren) auf Neuritenwachstum (Abb. 1) zu untersuchen.

Es sind wichtige Schritte in der Prozedur, müssen modifiziert oder für unterschiedliche Anwendungen optimiert werden kann. Diese Schritte sind auch wichtige Variablen für trouble-shooting Experimente, die sich als erfolglos erscheinen. Erstens, Neurotrophin-3 (NT-3), Ciliary neurotrophen Faktors (CNTF) und ITS (Insulin, Transferrin, Selen) wurden dem Kulturmedium zugegeben, um SAG Neuron Überleben fördern und zu verbessern Neuritenwachstum ^6,8. Diese Wachstumsfaktoren sind im Rückenmark Experimente einbezogen, um die Bioaktivität von Molekülen unter den gleichen Testbedingungen, dass die SAG Explantate wurden getestet testen. Jedoch können auch andere Wachstumsfaktoren, besser geeignet für diese und andere Gewebearten. Zweitens wurde eine 1,5 mg / ml-Konzentration von Kollagen nach der Prüfung einer Reihe von Kollagen-Konzentrationen (0,5, 1,0, 1,5 und 2 mg / ml), da es die robusteste Neuritenwachstum von der E4 Huhn SAG produzierten nach 24 Stunden gewählt. Andere Quellen von Neuronen zeigt möglicherweise eine andere optimale Kollagen. Schließlich sollte die Protein-Konzentrationen, die Anzahl der Perlen, und der Abstand zwischen den Explantaten und Perlen auch für jede Anwendung optimiert werden. Einige Wachstum der Tators, wie Morphogene sind in Gradienten ausgedrückt und üben Konzentrations-abhängige Effekte auf die wachsenden Axone während der Entwicklung ^11. Daher sollte eine Reihe von Konzentrationen immer mit Neuritenwachstum Assays getestet werden. Es ist darauf zu Toxizität zu vermeiden: Wir haben erhöhte Werte von Zelltod mit hohen Konzentrationen von einigen Proteinen beobachtet (zB, Sonic hedgehog).

Diese Methode kann für zusätzliche Anwendungen, einschließlich anderer Altersstufen, Gewebearten, Co-Kultur-Methoden und zusätzliche Immunfärbung (zB, das Überleben der Zelle Assays) angepasst werden. Wir haben erfolgreich kultiviert E3-E5 SAG, E6 Retina und E7 Riechkolben Explantate von Küken, mit den gleichen Kulturbedingungen. Als Folge robust in Kontrollproben ist, kann dieses Verfahren auch zeigen, abstoßend Antworten auf sezernierte Faktoren. Ähnliche Methoden wurden für den Test Auswirkungen Morphogene auf Säugetier-Neuronen ^12,13 verwendet, und wir untersuchen derzeit die Auswirkungen der BMPs, FGFs und Shh auf SAG Neuritenwachstum. Auch, weil die Kollagen-Gelen in einer 24-Well-Platte polymerisiert werden, sind sie groß genug sind für eine spätere Einbettung und Schneiden mit einem Kryostaten. Wir routinemäßig TUNEL-Assays auf Gefrierschnitten von Kollagen-Gel Kulturen, die uns auf das Niveau der das Überleben der Zelle mit der Menge der Neuriten aus der gleichen Probe ⁸ korrelieren können.

Es gibt Einschränkungen zur Verwendung der Kollagen-Gel-Assays in den Weg, dass wir sie hier vorgestellten. Zum Beispiel können Reaktionen in der bewusst in vitro-Umgebung vereinfacht beobachtet nicht unbedingt Antworten auf die gleichen Faktor, wenn es in die komplexeren in vivo Situation. Wie gut, können wir nicht unterscheiden periphere von zentralen Prozessen und nicht unterscheiden kann, auditive aus vestibulären Neuriten. Daher könnte Heterogenität in Reaktionsfähigkeit bei diesen Populationen ergeben unregelmäßigen oder ungleichmäßigen Auswuchs oder, wenn die Reaktion der Bevölkerung einen kleinen Bruchteil der istInsgesamt kann das Ganglion wie zeigt keine Wirkung erzielt werden. Schließlich haben wir eine Methode, die zur Kultur E4 SAG Explantate unter serumfreien Bedingungen mit erheblichen Neuron Überleben eingesetzt werden präsentiert, mit einer Vielzahl von Anwendungen aus dem Studium das Überleben der Zelle zu Axon Führung. Insgesamt ist dieses System von Vorteil, weil es einer kann, um Effekte durch die Zugabe von gereinigtem Faktoren allein oder in Kombinationen, ohne die Störvariablen von anderen abgesondert Faktoren und Axon Führung Signale, die vorhanden sein in der in vivo-Umgebung kann zu überwachen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well