Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes
Summary
Deze video demonstreert de procedures voor de karakterisering van humane pancreatische eilandjes met hematoxyline en eosine (H & E) en immunohistochemie (IHC). Pancreas delen van het hoofd, lichaam en staart regio's worden gekleurd door zowel H & E en IHC te eilandje endocriene samenstelling (insuline, glucagon, en pancreas polypeptide), cel-replicatie (Ki67) en inflammatoire infiltraten (H & E, CD3) te bepalen. De uncinate regio is gelokaliseerd met behulp van IHC voor pancreas polypeptide.
Abstract
Schattingen van eilandje gebied en nummers en endocriene cellen samenstelling in de volwassen menselijke pancreas variëren van enkele honderdduizenden tot enkele miljoenen-en beta-massa bereiken 500 tot 1500 mg 1-3. Met deze bekende heterogeniteit, is een standaard verwerking en kleuring procedure ontwikkeld, zodat de pancreas regio's duidelijk waren omschreven en eilandjes gekarakteriseerd met behulp van strenge histopathologie en immunolocalization examens.
Gestandaardiseerde procedures voor de verwerking van de menselijke alvleesklier hersteld van orgaandonoren zijn beschreven in deel 1 van deze serie. De alvleesklier wordt verwerkt in 3 grote regio's (hoofd, lichaam, staart), gevolgd door dwarsdoorsneden. Dwarsprofielen van de alvleesklier hoofd zijn verder onderverdeeld, zoals aangegeven op basis van grootte, en genummerd op alfabetische volgorde de onderafdelingen aan te duiden. Deze standaardisatie zorgt voor een volledige dwarsdoorsnede-analyse van het hoofd regio, waaronder de uncinate regio die bestaat uit eilandjes bevatvoornamelijk uit de pancreas polypeptide cellen naar de staart regio.
Het huidige rapport bevat deel 2 van deze serie en beschrijft de procedures die worden gebruikt voor seriële snijden en histopathologische karakterisering van de pancreas paraffinecoupes met de nadruk op eilandje endocriene cellen, replicatie, en T-cel infiltreert. Pathologie van de pancreas secties is bedoeld om zowel de exocriene, ductular, en endocriene componenten te karakteriseren. De exocrine compartiment wordt onderzocht op de aanwezigheid van pancreatitis (actieve of chronisch) atrofie, fibrose en vetten, alsmede het kanalensysteem, vooral in verband met de aanwezigheid van pancreatische intraductal neoplasie 4. Eilandjes worden beoordeeld op morfologie, de grootte en dichtheid, endocriene cellen, ontsteking, fibrose, amyloid, en de aanwezigheid van replicerende of apoptotische cellen met behulp van H & E en IHC vlekken.
Het laatste onderdeel beschreven in deel 2 is de bepaling van de gebrandschilderde afbeeldings in gedigitaliseerde objectglaasje beelden. De gedigitaliseerde dia's worden georganiseerd door het geval en de alvleesklier regio in een online databank pathologie het creëren van een virtuele biobank. Toegang tot deze online collectie is momenteel aan meer dan 200 clinici en wetenschappers die betrokken zijn bij type 1 diabetes onderzoek. De online database biedt de mogelijkheid voor een snelle en volledige uitwisseling van gegevens en voor de onderzoekers om blokken voor paraffine of ingevroren seriële secties te selecteren.
Protocol
Discussion
Standaardisatie van IHC-procedures is van cruciaal belang voor het imago van de analyse, met name bij het gebruik van computer-gebaseerde algoritmen in een groot aantal dia's in de tijd. De IHC kleuring procedure zoals beschreven in dit rapport zal batch analyse van de monsters een bepaalde donor met behulp van een Autostainer binnen een 8-urige werkdag en worden aangepast van een eerder verslag 5. Gedigitaliseerde hele dia's van elk glas dia's ter beschikking gesteld van nPOD-gelieerde onderzoeke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de donateurs de familie en de Organ Procurement Organisaties die betrokken zijn bij dit onderzoek en Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, en Roshan Agarwal voor hun deskundige hulp. Dit werk werd gefinancierd door de Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) ter ondersteuning van het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
| Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
| Paraffin | ||||
| Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
| CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
| CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
| Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
| C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
| Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
| Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
| Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
| Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
| Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
| Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
| Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
| Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
| Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
| Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
| CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
| CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
| Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.
References
- In’t Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).
- Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
- Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
- Veld, I. n. ‘. t., P, . Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).
