Окрашивание протоколы по правам островков поджелудочной железы
Summary
Это видео демонстрирует процедур для характеристики человека панкреатических островков использованием гематоксилином и эозином (H & E) и иммуногистохимии (IHC). Поджелудочной разделы с головы, тела и хвоста регионов окрашиваются как H & E и IHC, чтобы определить островок состав эндокринной (инсулин, глюкагон и панкреатический полипептид), ячейка репликации (Ki67), воспалительные инфильтраты (H & E, CD3). Крючковатыми области локализован использованием IHC для панкреатический полипептид.
Abstract
Оценки островок области и цифры и эндокринной клеточного состава в поджелудочной железе взрослого человека варьируют от нескольких сотен тысяч до нескольких миллионов и бета масса колеблется от 500 до 1500 мг 1-3. С этой известной неоднородности, стандартной обработки и окрашивания процедура была разработана таким образом, что поджелудочной регионов были четко определены и островков характеризуются использованием строгих гистопатология и immunolocalization экзаменов.
Стандартизированных процедур обработки поджелудочной железы человека оправился от доноров органов описаны в части 1 этой серии. Поджелудочная железа перерабатывается в 3-х основных регионов (голова, тело, хвост), а затем поперечные срезы. Поперечные сечения из головки поджелудочной железы делятся, как указано в зависимости от размера, и пронумерованы в алфавитном порядке для обозначения подразделов. Такая стандартизация позволяет для полного сечения анализ главы региона, включая крючковатыми область, которая содержит островки состоятв первую очередь панкреатический полипептид клеток хвоста региона.
Нынешний доклад включает в себя части 2 этой серии, и описываются процедуры, используемые для серийных срезов и гистопатологические характеристики поджелудочной парафиновых срезах с акцентом на островковых клеток эндокринной, репликации и Т-клеточные инфильтраты. Патология поджелудочной железы разделы предназначены для характеристики как экзокринной, дуктулярных и эндокринные компоненты. Экзокринной купе оценивается на наличие панкреатита (активный или хронические заболевания), атрофия, фиброз и жир, а также системы воздуховодов, особенно в связи с наличием сахарного внутрипротокового неоплазии 4. Островки оцениваются по морфологии, размеров и плотности, эндокринных клеток, воспаление, фиброз, амилоида, а также наличие тиражирование и апоптоза клеток с использованием H & E и IHC пятна.
Последний компонент описаны в части 2 является предоставление окрашенных слайдовкак с цифровых изображений слайд целом. Оцифрованных слайдов организованы случае и поджелудочной железы в области онлайн-базы данных патологий создания виртуального Биобанк. Доступ к этому онлайн-коллекции в настоящее время обеспечивается в более чем 200 врачей и ученых, участвующих в сахарный диабет 1 типа исследований. Интернет-база данных предоставляет средства для быстрого и полного обмена данными и для исследователей, чтобы выбрать блоки для парафиновых или замороженных серийных срезов.
Protocol
Discussion
Стандартизация процедур IHC имеет решающее значение для анализа изображений, особенно при использовании компьютерных алгоритмов через большое количество слайдов с течением времени. Процедура IHC окрашивания, описанные в этом докладе, позволит партии анализ образцов данного донора, исп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доноров, семей и органов заготовительных организаций, участвующих в этом исследовании и Эмили Монтгомери, Роберт Петрас, Энн-фу, Mitali Agarwal, и Roshan Agarwal за экспертную помощь. Эта работа финансировалась по делам несовершеннолетних исследований диабета Foundation (MC-T.) в поддержку сети поджелудочной доноров органов с диабетом.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
| Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
| Paraffin | ||||
| Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
| CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
| CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
| Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
| C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
| Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
| Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
| Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
| Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
| Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
| Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
| Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
| Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
| Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
| Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
| CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
| CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
| Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.
References
- In’t Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).
- Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
- Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
- Veld, I. n. ‘. t., P, . Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).
