Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas
Summary
Este vídeo demonstra os procedimentos para caracterização de ilhotas pancreáticas humanas com hematoxilina e eosina (H & E) e imuno-histoquímica (IHQ). Seções pancreáticas de cabeça, corpo e regiões da cauda estão manchadas por tanto H & E e IHC para determinar a composição endócrino ilhéu (insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático), a replicação celular (Ki67), e infiltrado inflamatório (H & E, CD3). A região uncinado está localizado usando IHC para polipeptídeo pancreático.
Abstract
As estimativas de área de ilhotas e os números e composição endócrino célula no pâncreas humano adulto variar de várias centenas de milhar a gamas de massa vários milhões e beta de 500 a 1500 mg 1-3. Com essa heterogeneidade conhecido, um tratamento padrão e procedimento de coloração foi desenvolvido para que as regiões pancreáticas foram claramente definidos e ilhotas caracterizados por histopatologia rigorosa e exames imunolocalização.
Procedimentos padronizados para o processamento de pâncreas humano recuperado de doadores de órgãos são descritos na parte 1 desta série. O pâncreas é processado em 3 regiões principais (cabeça, corpo, cauda), seguido de cortes transversais. Secções transversais da cabeça do pâncreas são ainda divididas, tal como indicado com base no tamanho, e numerados em ordem alfabética para denotar subsecções. Esta normalização permite uma análise completa transversal em corte da região da cabeça, incluindo a região que contém uncinado ilhotas compostosprincipalmente de células pancreáticas polipéptido para a região da cauda.
O presente relatório compreende parte 2 desta série e descreve os procedimentos utilizados para cortes seriados e caracterização histopatológica das seções pancreáticas de parafina com ênfase em células endócrinas das ilhotas, replicação e de células T infiltrados. Patologia de secções pancreáticas destina-se a caracterizar tanto exócrino, ductular, e componentes endócrinos. O compartimento exócrino é avaliada quanto à presença de pancreatite (activo ou crónica), atrofia, fibrose, e gordura, bem como o sistema de condutas, particularmente em relação à presença de neoplasia pancreática intraductal 4. Ilhotas são avaliadas para a morfologia, tamanho e densidade, células endócrinas, inflamação, fibrose, amilóide, bem como a presença de células replicantes ou apoptótico utilizando H e E e as manchas de IHC.
O componente final descrito na parte 2 é o fornecimento da lâmina coradas como digitalizados imagens de diapositivos inteiras. Os slides digitalizados são organizados por caso e região do pâncreas em um banco de dados on-line patologia criar um biobanco virtual. O acesso a esta coleção on-line está actualmente previsto para mais de 200 médicos e cientistas envolvidos na pesquisa do diabetes tipo 1. O banco de dados on-line fornece um meio para a rápida e completa partilha de dados e para os investigadores para selecionar blocos de parafina ou congelados cortes seriados.
Protocol
Discussion
Padronização da IHC procedimentos é crítica para a análise de imagem, especialmente quando se utiliza algoritmos baseados em computador através de um grande número de lâminas ao longo do tempo. O processo de coloração IHQ descritos neste relatório permitirá a análise do lote de amostras de um doador dado, utilizando um Autostainer dentro de um dia de trabalho de 8 horas e são modificadas a partir de um relatório anterior 5. Digitalizadas imagens de slides inteiros de cada slide manchado disponi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem as famílias dos doadores e as Organizações de Procura de Órgãos envolvidos na pesquisa e Montgomery Emily, Pietras Robert, Fu Ann, Agarwal Mitali, e Agarwal Roshan para a sua assistência especializada. Este trabalho foi financiado pela Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) em apoio da Rede de Doadores de Órgãos do pâncreas com Diabetes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
| Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
| Paraffin | ||||
| Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
| CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
| CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
| Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
| C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
| Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
| Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
| Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
| Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
| Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
| Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
| Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
| Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
| Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
| Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
| CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
| CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
| Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.
References
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