ヒト膵島の染色プロトコル
Summary
このビデオでは、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）と免疫組織化学（IHC）を用いたヒト膵島の特性評価のための手順を示しています。頭、体、尾領域から膵臓のセクションは膵島内分泌物（インスリン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド）、細胞複製（Ki67）、および炎症性浸潤（H＆E、CD3）を決定するためにH＆EとIHCの両方で染色されています。鉤状領域は、膵ポリペプチドに対してIHCを使用してローカライズされています。
Abstract
膵島面積と数字および成人ヒト膵臓の内分泌細胞組成の推定値は数十万から500〜1500 mgの1-3に数百万とベータの質量範囲に異なります。この既知の不均一性と、標準処理と染色手順は、膵臓領域を明確に定義されており、島には厳格な組織病理学および免疫学的局在診断を用いて特徴づけたように開発されました。
臓器提供者から回収されたヒト膵臓を処理するための標準的な手順は、このシリーズのパート1で説明されています。膵臓は、横断に続いて3つの主要領域（頭、体、尾）に処理されます。膵臓の頭部からの横断は、サイズに基づいて示されているように、さらに分割し、サブセクションを示すためにアルファベット順に番号が付けられています。この標準化は、構成の小島が含まれている鉤状領域を含む頭部の完全な断面分析を可能にする主に尾部領域、膵ポリペプチドの細胞。
現在のレポートには、このシリーズのパート2を含み、シリアルセクショニングと膵島内分泌細胞、レプリケーション、およびT細胞の浸潤に重点を置いた膵のパラフィン切片の病理組織学的特性評価に使用する手順について説明します。膵臓切片の病理は、外分泌、ductular、内分泌の両方のコンポーネントを特徴づけることを意図しています。外分泌コンパートメントは、特に膵臓の膵管内腫瘍4の存在との関係では、膵炎（アクティブまたは慢性）、萎縮、線維症、脂肪の存在だけでなく、ダクトシステムに評価されます。膵島の形態、大きさ、密度、内分泌細胞、炎症、線維症、アミロイド、およびH＆EとIHC染色を使用して複製またはアポトーシス細胞の有無を評価されます。
パート2で説明した最後のコンポーネントは、染色されたスライドの提供です。デジタル化されたスライド全体のイメージとしての。デジタル化されたスライドは、仮想バイオバンクを作成するオンライン病理データベースの場合、膵臓領域によって構成されています。このオンラインコレクションへのアクセスは現在、1型糖尿病の研究に関与して200以上の臨床医と科学者に提供されています。オンラインデータベースは、迅速かつ完全なデータ共有のために、パラフィンまたは凍結連続切片のブロックを選択するための捜査手段を提供します。
Protocol
Discussion
IHC手順の標準化は、時間をかけてスライドの多数を越えて、コンピュータベースのアルゴリズムを使用する場合は特に、画像解析のために重要です。このレポートに記載されIHC染色の手順は、8時間の作業日以内にautostainerを使用して、特定のドナーのサンプルのバッチ分析をできるようになり、以前の報告書5から変更されます。各染色されたスライドのデジタル化されたスライド全…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ドナーの家族や専門家の支援のため、本研究とエミリー·モンゴメリー、ロバートPietras、アンフー、Mitali Agarwalさんと、ロシャンAgarwalさんに関与する臓器調達機関に感謝します。この作品は、糖尿病患者の膵臓の臓器提供者のネットワークをサポートするために青少年糖尿病研究財団（MC-T.）によって資金を供給された。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
| Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
| Paraffin | ||||
| Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
| CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
| CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
| Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
| C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
| Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
| Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
| Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
| Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
| Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
| Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
| Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
| Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
| Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
| Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
| CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
| CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
| Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.
References
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- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
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