Utilisation de la souris BLT humanisé comme une tumeur de cellules souches Gene Therapy modèle basé sur

Summary

La génération et la caractérisation des tumeurs des cellules T spécifiques en utilisant des souris humanisés est décrit ici. Human tissu thymique et génétiquement modifiés cellules souches hématopoïétiques humaines sont transplantées dans des souris immunodéprimées. Cela se traduit par la reconstitution d'un système immunitaire humain ingénierie permettant l'examen in vivo des réponses anti-tumorales immunitaires.

Abstract

De petits modèles animaux tels que des souris ont été largement utilisées pour étudier les maladies humaines et à développer de nouvelles interventions thérapeutiques. Malgré la richesse des informations obtenues à partir de ces études, les caractéristiques uniques de l'immunité de la souris ainsi que la spécificité d'espèce des maladies virales comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) a conduit au développement de modèles murins humanisés. Les modèles précédents impliquaient l'utilisation de C. B 17 scid / scid souris et la transplantation de l'homme thymus foetal et le foie du fœtus appelés ton / liv (SCID-hu) ^{1, 2} ou le transfert adoptif de l'homme leucocytes du sang périphérique (SCID-huPBL ) ^3. Les deux modèles ont été principalement utilisés pour l'étude de l'infection par le VIH.

L'une des principales limites de ces deux modèles est le manque de reconstitution stable de cellules immunitaires humaines dans la périphérie pour en faire un modèle plus physiologiquement pertinente pour étudier la maladie du VIH. À cette fin, le bourdonnement BLTmodèle de souris anized a été développé. BLT est synonyme de moelle osseuse / foie / thymus. Dans ce modèle, de 6 à 8 semaine vieux NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) des souris immunodéprimées recevoir l'implant ton / liv comme dans le modèle de souris SCID-hu ne doit être suivie d'une deuxième transplantation de cellules souches hématopoïétiques humaines ^4. L'avantage de ce système est la reconstitution complète du système immunitaire humain dans la périphérie. Ce modèle a été utilisé pour étudier l'infection à VIH et la latence ^5-8.

Nous avons généré une version modifiée de ce modèle dans lequel nous utilisons génétiquement modifiés cellules souches hématopoïétiques humaines (HHSC) pour construire l'implant ton / liv suivie d'une injection autologue de transduction HHSC ^{7, 9.} Cette approche se traduit par la génération de lignées génétiquement modifiées. Plus important encore, nous avons adapté ce système pour étudier le potentiel de générer des cellules fonctionnelles T cytotoxiques (CTL) exprimant un mélanome récepteur des cellules T spécifiques. En utilisant ce modèle, nous avons pu évaluer la fonctionnalité de notre CTL transgénique en utilisant en direct par émission de positrons (TEP) pour déterminer la régression tumorale (9).

L'objectif de ce protocole est de décrire le processus de génération de ces souris transgéniques et d'évaluer l'efficacité in vivo utilisant l'imagerie TEP en direct. Comme une note, car nous utilisons des tissus humains et les vecteurs lentiviraux, nos installations sont conformes aux directives du NIH pour la CDC de biosécurité de niveau 2 (BSL2) avec des précautions particulières (BSL2 +). En outre, les souris NSG sont gravement immunodéprimés par conséquent, leur logement et de maintenance doivent être conformes aux normes les plus élevées de santé ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Production de souris BLT

La génération de souris BLT est divisé en trois (3) parties: (1) traitement de tissus fœtaux et la préparation du CD34 des cellules souches hématopoïétiques, (2) la transplantation de tissus humains, et (3) de greffe secondaire. Pour tous les protocoles, nous avons fourni le tableau 1 de l'information réactif.

1. Traitement des tissus et isolement de CD34 cellules souches hématopoïétiques humaines

Frais tissus fœtaux ou d'un tissu moins chere sur la glace de divers organismes d'approvisionnement en organes peuvent être utilisés. Souvent, les tissus fœtaux n'est pas stérile, comme en témoigne la production de 1.000 colonies bactériennes sur gélose au sang par millilitre de milieu environnant. Nous avons régulièrement laver le tissu à deux reprises dans 40 ml de PBS stérile. Bien que cela ne supprime pas toutes les bactéries, il peut faire une différence entre une série greffe réussie et un résultat dans lequel la plupart des souris receveuses succombent aux infections bactériennes dansfection. Comme une étape supplémentaire, à désinfecter en outre le tissu, on la culture de la suspension cellulaire en présence d'antibiotiques.

1.1 Traitement des tissus du thymus fœtal

1. Laver le thymus par décanter le milieu dans un bécher d'eau de Javel et d'utiliser un scalpel pour empêcher le tissu de glisser dans l'eau de Javel. Remplir le tube avec du PBS. Cap et la retourner plusieurs fois pour laver le thymus. Décanter le surnageant dans l'eau de Javel. Répéter.
2. Placez le tissu du thymus dans 8 ml de RPMI + 10% de sérum de veau foetal dans un plat de 60 mm et de cisaillement dans 1,5 mm à 2 pièces avec deux scalpels. Cisaillement avec des scalpels minimise la déchirure et endommager les bits de tissus. Les tissus endommagés tend à devenir enflé, collant et difficile à tracer dans l'aiguille implant. Le nombre de bits obtenue est la première limite supérieure sur des souris transplantables.
3. Transférer les bits en suspension avec une pipette de 25 ml (pour minimiser les dommages aux tissus) dans un flacon T25. Ajouter 70 ul de piptazo (Zosyn) au ballon et à la culture du jour au lendemain, 2. Cela réduit considérablement les bactéries contaminantes. Si vous souhaitez faire le typage tissulaire ou d'essais de phénotypage autres, sortir 1 ml de cellules.

1.2 Traitement des tissus du foie fœtal

1. Laver le foie que dans l'étape 1.1.1.
2. Ajouter 10 ml de tout moyen et décanter Iscove dans un plat de Pétri de 100 mm.
3. Avec deux scalpels, dés le foie en petits (~ 3 mm) pièces. Si vous rencontrez des tissus conjonctifs blanc, grattez le foie de lui et le jeter dans l'eau de javel.
4. Homogénéiser le tissu par aspiration dans une seringue de 12 ml munie d'une aiguille de calibre 16 émoussée 3 ou 4 fois et de transfert pour un tube de 50 ml.
5. Préparer les enzymes pour la digestion des tissus comme suit: A 10 ml d'Iscove dans un tube de 50 ml, ajouter 200 ul de chacun: la collagénase de type IV (1 mg / ml), la hyaluronidase (1 mg / ml), de DNase I (2 U / ml).
6. Dessinez enzymes dans une seringue de 12 ml et l'équiper d'un filtre de 0,22 μ. Filtrer la ENZYme / support directement dans la suspension cellulaire.
7. Cap et sceller les cellules avec du Parafilm. Faire tourner à 37 ° C pendant 90 min.
8. Mettre en place un tube de 50 ml avec un tamis de 100 μ cellule. Pipeter la cellule digérer grâce à ce filtre.
9. Ajouter PBS aux cellules pour obtenir un volume de 50 ml. Diviser cela en deux tubes de 25 ml.
10. Sous-tendaient les cellules avec 10 ml de Ficoll. Centrifuger à 2400 rpm pendant 20 min sans frein.
11. L'interface doit être épaisse. Suck it avec une pipette de 5 ml et le transfert dans un autre tube. Vous devez avoir deux tubes de l'interface. Ajouter 50 ml de PBS à chaque tour et à 1200 rpm pendant 10 min.
12. Mélanger les granules dans un tube et laver trois fois de plus avec du PBS contenant 2% de FCS.
13. Enfin suspendre dans 50 ml de RPMI + 10% de FCS et de comptage des cellules en utilisant du bleu trypan. En fonction de la taille du tissu, vous pouvez obtenir à partir ^{8 octobre} au ^{9 octobre} hépatocytes total.
14. Transférer les cellules dans un flacon T150 et ajouter 30 ml de RPMI + 10% de FCS et 0,8 ml de piptazo.
15. Incuber pendant 1 à 1,5 heure à 37 ° C pour éliminer les cellules adhérentes.

1.3 Le tri et la transduction des cellules souches hématopoïétiques CD34

1. Après la fixation des cellules à l'étape 1.2.15, agiter le flacon avant et en arrière doucement pendant une minute pour déloger les cellules lâches. Il y aura beaucoup de fibroblastes et coincées par exemple à la surface.
2. Comptez à nouveau en utilisant une dilution de 1 à 20 et inscrivez le nombre total de cellules. Enregistrer quelques dixièmes de ml pour coloration plus tard. Vous devriez avoir environ 30% de cellules de moins de nombre de vos cellules initiales (étape 1.2.13).
3. Isoler et laver deux fois avec 40 ml de tampon MACS.
4. Cellules CD34 sont triés à l'aide Miltenyi Biotech CD34 Kit Direct. Nous suivre exactement le protocole du fabricant en utilisant des colonnes LS fournis par la même société.
5. Cellules récupérées seront dans 5 ml. Compter et calculer cellules totales. Votre rendement des cellules CD34 + doit être 3-5% de vos numérations cellulaires totales. Cela varie avec ee âge du foie fœtal. Les jeunes foies foetaux ont tendance à donner un rendement plus élevé de cellules CD34 +.
6. Diviser le nombre de cellules par 1x10 ^6. Cela donne la seconde limite supérieure sur des souris transplantables.
7. Comptez le CD34-fraction (débit à travers et lavages) et réserve de 6 x 10 ⁶ par souris à transplanter. Culture ces cellules pendant la nuit dans 50 à 80 ml de RPMI + 10% sérum de veau foetal + 1% piptazo.
8. Transduire les cellules CD34 + au jour le jour avec votre vecteur lentiviral. Nous utilisons rétronectine par Takara suivant exactement les instructions du fabricant.
9. Le lendemain, la récolte, les cellules CD34-, CD34 + cellules transfectées et de comptage.
10. Fractionner les cellules CD34 + en deux: la partie A et la partie B.
11. Isoler la partie A, les cellules CD34 + transduites et mettre en suspension dans 4 à 6 ml de milieu de congélation (RPMI + 10% FCS + 10% de DMSO, 0,22 μ filtrée stérile). Mettez aliquotes de 1 ml dans des flacons de gel et d'étiquettes avec "huFetalCD34", le nombre de cellules dans le flacon, la date et vos initiales.
12. Pour chaque souris mélanger 0.5x10 ⁶ Partie B CD34 + cellules transduites et 4.5x10 ⁶ cellules CD34-dans un tube à centrifuger à bouchon à vis stériles, granulés et garder sur la glace. Aussi décongeler un tube de Matrigel (BD Biosciences) sur la glace. Tous ces tubes doivent être conservés sur de la glace jusqu'à utilisation (passez à l'étape 2.10).

2. La transplantation de tissus

Le but de cette étape est de transplanter un thymus fœtaux humains / organoïdes foie sous la capsule rénale de souris NSG. Cette organoïde imite mieux le processus de sélection des cellules T humaines et des processus de maturation que les cellules souches hématopoïétiques humaines va utiliser le thymus humains et non la souris comme site de leur différenciation en cellules T différente et d'autres lignées lymphoïdes. L'utilisation des cellules CD34 dans le processus de transplantation est de re-générer le stroma de foie foetal et permettant une meilleure croissance et la transplantation de l'implant. L'âge de la souris NSG utilisés est de 6-8 semaines.

1. Préparation de médicaments pour surgery:
   1. L'isoflurane: Enroulez un morceau de gaze de 2 pouces et le farcir dans un tube de centrifugeuse de 15 ml bouchon à vis. Verser dans environ 1 ml d'isoflurane directement à la bouteille.
   2. La kétamine / zylazine: Ajouter 0,52 ml de kétamine (Ketaset) (100 mg / ml) et 0,52 ml de xylazine (Anased) (100 mg / ml) dans un flacon de 20 ml de solution saline pour injection. Étiquette avec la date d'expiration de la première composante expirant et garder au congélateur à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
   3. Carprofène (Rimadyl). Diluer cette juste avant une intervention chirurgicale. Diluer 1:100 en retirant 0,1 ou 0,2 ml du flacon avec une seringue de 1 ml et une aiguille 25G. Injecter dans une quantité de 10 ml ou 20 de solution saline pour injection. Étiquette et la date. Conserver au réfrigérateur pendant une journée seulement. Charge en 3 seringues avec des aiguilles 25G ml.
2. Mettre en place la table pour les chirurgies. Recouvrez-la de stériles tampons bleus, et une serviette stérile pour chaque chirurgien. Chaque chirurgien reçoit dans sa boîte d'instruments stérilisés: 4 "ciseaux, pinces courbes arrondies, doiventle-nez pince hémostatique, 16G, trocart émoussé, et l'applicateur Agrafe chirurgicale. En outre, ils ont besoin d'une suture à l'aiguille courbe Vicryl, une pile de paquets essuyez l'isopropanol, un plat de Pétri de 35 mm de PBS, et une seringue de 1 ml remplie avec du PBS.
3. Situé dans le centre de la table un bocal en verre Coplin avec 2 cm de Bétadine et 2 cotons-tiges. Verser les bits du thymus dans un plat de Pétri de 60 mm.
4. L'anesthésie est effectuée sur une table séparée ou dans une hotte stérile recouverte d'plots bleus. Mis en place deux petits casiers et une balance électronique avec un gobelet de tenir les souris. Utiliser une crémaillère pour maintenir 0,5 ml seringues à insuline X 28G chargés de kétamine / xylazine et l'autre pour maintenir les seringues 3 ml de carprofène. Également déplacer le conteneur déchets biologiques dangereux à proximité de maintenir la fourrure rasée.
5. Peser toutes les souris (6-8 semaines) dans une cage pour obtenir le poids moyen et les seringues de charge avec une dose de 15 ul / g de kétamine / xylazine. Injecter toutes les souris dans la cage.
6. Après les souris deviennent paresseux se rasent lefcôté t de la hanche à l'épaule entre le centre du dos et le ventre avec une tondeuse Oster avec lame n ° 40. Noter leur poids, et le punch leurs oreilles pour la numérotation.
7. Injecter 0,3 ml carprofène voie sous-cutanée sur l'épaule.
8. Vérifier le niveau d'anesthésie de la souris en appuyant sur une patte. Si les tressaillements de la souris, l'administration d'isoflurane partir d'un tube d'environ 12 sec. Ensuite, essayez de le resserrement patte à nouveau. Continuez à donner des coups courts de l'isoflurane jusqu'à ce que la patte réflexe disparaît. Posez la souris sur le côté droit tourné vers la gauche.
9. Une aiguille de 16 G cancer implant, avec la pointe ronde déposé est utilisé pour insérer le tissu. Rincer le trocart à quelques reprises dans le plat de PBS. Tenant à l'horizontale avec la tige juste à l'intérieur de la pointe. Ajouter un morceau de thymus avec une pince à bec effilé et le sucer po
10. Un assistant ajoute 5 ul de Matrigel froid à un tube de cellules (étape 1.3.12) avec une pipette Eppendorf déplacement positif, et se mélange par agitation douce. Le chirurgien holds le trocart horizontalement et tire la tige lentement car l'aide des pipettes le mélange Matrigel dans le trocart. Le mélange se gélifie à la température ambiante.
11. Nettoyer la peau nue avec de la Bétadine. Ensuite, essuyez cet arrêt avec une isopropanol essuyer. Répéter.
12. Localisez la rate sous la peau. Il est le plus sombre tache. Les reins de la souris se trouve à environ 5 mm dorsale de la rate, ce qui peut être vu à travers la peau rasée.
13. Procurez-vous la peau sur ce point avec les forceps émoussé et faire une coupe parallèle à la rate d'environ 15 mm de long. Faites une coupe similaire à la couche musculaire péritoine ci-dessous. Chez les hommes, le rein doit être directement visible et il vous suffit de presser le ventre pour la faire sortir. Chez les femelles, vous pouvez avoir à ramasser l'ovaire avec la pince hémostatique et faites glisser le rein. Cela peut contribuer à retenir le rein à l'extérieur du corps. Pour les hommes, vous devrez garder une certaine pression sur l'abdomen avec la main gauche pour garder les reins exposés.
14. Pluck un petit trou dans le posterior extrémité de la capsule rénale. Il peut saigner un peu.
15. Glisser le trocart dans ce trou et le long du rein jusqu'à l'orifice de la trocart est complètement recouverte par la capsule rénale. Ensuite, en utilisant le petit doigt de la main droite, injecter le tissu.
16. Poussez le rein de retour en douceur avec la pince hémostatique fermé. Mettez un point dans le péritoine, à égalité avec un savoir-double. Pressez la peau comme un sac à main et mis dans deux clips de la plaie.
17. Mettre une goutte de PBS sur chaque œil et poser la souris sur le côté sur le lit cage. Assurez-vous que toutes les souris sont retournés à la pose sur le ventre avant de les quitter.
18. Le lendemain, donnez à chaque souris un autre coup de carprofène.

3. Secondaire transplantation

L'objectif de cette étape dans la génération de souris BLT est de peupler la moelle osseuse moue avec des cellules souches hématopoïétiques. L'implant transplanté de la procédure (2) n'est pas suffisante pour soutenir la reconstitution complète de ee système immunitaire humain chez ces souris. Au cours de la greffe secondaire, on sous-létale irradier les souris à épuiser cellules de moelle osseuse murine générant ainsi un «espace» pour l'implantation des cellules CD34 + humaines.

1. Quatre à six semaines plus tard irradier les souris avec 2,7 Gy. Les souris sont injectées le même jour à la partie A de cellules CD34 + transduites. Le calendrier est basé sur la création et la croissance de l'implant ton / liv transplantés à l'étape 2. En règle générale, pendant ce temps l'implant a augmenté de façon significative nous permettant de procéder aux étapes suivantes.
2. Dégeler la partie A de cellules CD34 + transduites, laver et suspendre dans un milieu à une concentration de 5x10 ⁶ / ml.
3. Chargez 0,5 ml seringues d'insuline X 28G avec 0,1 ml de cellules (10 ⁵ à 5x10 ⁵ cellules par 0,1 ml par souris) pour une cage de souris (chaque cage contient un maximum de 5 souris) et les déposer sur une grille opposé.
4. Anesthésier une souris avec un tube en l'isoflurane gommante et en maintenant sale nez dans les tubes pour environ 20 sec. Comptez de garder une trace du temps.
5. Puis il face à la droite, et tirez la peau autour de son cou serré avec le pouce et l'index de la main gauche. Appuyez sur sous sa mâchoire avec votre détecteur de tiers de sorte que son œil droit est bombé. En tenant la seringue parallèle à l'axe longitudinal de la tête de la souris, glissez l'aiguille derrière l'œil et faites-la glisser doucement jusqu'à ce qu'il s'arrête. N'appuyez pas plus loin, mais d'injecter la charge sur environ 2 secondes.
6. Deux à trois mois plus tard, les souris sont saignés retroorbitally l'aide de pipettes de verre enduits d'EDTA. Vous ne pouvez prendre un maximum de 200 ul de sang par mois et par la souris. 50-100 ul de sang doit être suffisant pour l'analyse FACS. Stratégies alternatives incluent des saignements saigne et saigne veine faciale veine de la queue. Ce dernier vous donnera de très petits volumes de sang qui peut ne pas être suffisante pour les tests multiples.
7. Des échantillons de sang sont colorées pour l'expression du marqueur CD45 des lymphocytes humains afin d'évaluer la reconstitution. BLood échantillons sont ajoutés dans 1 ml de tampon de lyse du sang de globules rouges (160 mM de NH ₄ Cl, 100 mM KHCO _3, 0,01 mM EDTA) et incubé pendant 5 min à température ambiante.
8. Laver les cellules dans un tampon de lyse, à 5 min à 1200 rpm, et répéter si nécessaire.
9. Centrifuger les cellules comme dans 3.8 et laver dans du PBS additionné de 3% sérum de veau foetal (FACS-PBS).
10. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 100 ul granulés FACS-PBS.
11. Ajouter des anticorps humains afin d'évaluer la reconstitution des lymphocytes. Nous comprennent généralement la suivante CD45 (marqueur des lymphocytes humains), CD8, CD4, CD14 et CD16 pour les macrophages et les monocytes, CD19 pour les cellules B CD56 et des cellules NK.
12. Incuber à 4 ° C pendant 30 min.
13. Laver comme à l'étape 3.9 et remettre en suspension les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% pour l'analyse FACS.
14. Si les souris sont reconstitués, nous procédons à des injections tumorales. Niveaux de reconstitution des lymphocytes humains varient de moins de 1% à 40% des cellules de sang total. Les niveaux et les types de lymphocYTE lignées sont comparables à ce qu'on peut attendre d'donneurs sains de sang humain. Cependant, nous attendons des fluctuations dans le nombre de lignées de cellules non-T. Si les chiffres ne sont pas acceptables dans le délai de 12 semaines, vous pouvez répéter la procédure de greffe secondaire à partir de l'étape 3.1.
15. Lignées cellulaires tumorales sont cultivées selon les recommandations du fabricant ou de laboratoire. Les cellules sont récoltées, lavées et remises en suspension dans du matrigel à un ratio de 1:1 (50 ul ul cellules/50 matrigel). Les échantillons sont conservés sur la glace en tout temps.
16. Les souris sont anesthésiées et rasé à la zone d'injection. La zone est stérilisé en utilisant un tampon d'isopropanol. A suspensions cellulaires charges d'assistance en pré refroidi 23G seringues de 1 ml. Les cellules tumorales sont injectées par voie sous cutanée. Traiter le site d'injection avec un onguent antibiotique. Les tumeurs doivent établir et commencer à croître en 4 semaines.

B. In vivo par émission de positons (TEP)

Pour nos études, nous avons examenl'absorption du glucose amine ^([18 F]-FDG ^([18 F] FDG) ainsi souris sont mis à jeun 4-6 heures avant l'imagerie. microTEP / CT scans sont effectués en utilisant la microTEP Inveon scanner (Siemens Solutions précliniques) et MicroCATII tomodensitomètre ( PreclinicalSolutions Siemens). L'analyse d'images est effectuée à l'aide d'OsiriX (Pixmeo, Suisse) logiciel. L'objectif est de mesurer l'activité métabolique de la tumeur et, finalement, d'utiliser l'imagerie TEP en tant qu'alternative à mesurer physiquement la régression tumorale. Comme le montre la figure 2, nous ont rencontré des tumeurs basées sur l'apparence physique et la taille ne sont pas ciblés mais l'imagerie TEP en direct a révélé une nécrose tissulaire étendue. Cette méthodologie peut servir d'indicateur plus sensible et précis de la régression tumorale.

1. Désigner une chambre pour anesthésier (2% isofluorane), les souris, et une chambre que l'absorption de 60 min FDG TEP avant ("en attente de chambre"). Placez tampons bleus dans les deux chambres.
2. Comme les animaux sont Anesthetized plus d'une longue période, il convient de les maintenir au chaud à 30 ° C grâce à l'utilisation de gants remplis d'eau qui sont chauffés dans un four micro-ondes et en plaçant les cages de coussinets thermiques.
3. Tournez le flux de l'isoflurane pour cette chambre sur. Permettre à l'isoflurane pour remplir la chambre anesthésiant pour environ 5-10 min avant de placer des souris dans la chambre. Assurez-vous que le couvercle est verrouillé et fermé hermétiquement pour éviter toute fuite isoflurane.
4. Placez la première souris dans la chambre anesthésiant et verrouiller le couvercle hermétiquement. Laisser 5-10 minutes ou jusqu'à ce que la souris est inconscient.
5. Débranchez la souris de la chambre anesthésiant, l'étiquette de la queue de la souris (couleur différente par cage) et injecter par voie intrapéritonéale à la souris avec la ^[18 F] FDG (80 pCi). Prenez note de l'heure de la souris a été injecté. La souris sera anesthésié à nouveau 50 mn de ce point de temps, ce qui permet pendant 10 min à mettre en place pour la TEP (pour le total de 60 minutes ^[18 F] FDG absorption avant la TEP).
6. Placez la souris injectée dans la chambre d'attente, ce qui permet ^[18 F] FDG pendant 1 h avant la TEP. Ne pas verrouiller le couvercle. Laissez le couvercle lâche pour laisser l'air circuler.
7. Immédiatement placer la souris à côté pour l'injection du FDG dans la chambre anesthésiant. Ultérieures injections doivent être espacées souris 10 min à part, parce que le processus de la TEP est de 10 min. Immédiatement après une souris est scanné, le 60 min FDG pour la souris à côté à numériser sera prête exactement 10 minutes d'intervalle.
8. Continuer anesthésier et injectant à des souris comme indiqué dans les étapes 7-9.
9. Après 50 mn de l'injection timepoint première souris, placez la souris d'abord injecté dans la chambre anesthésiant à nouveau (tout en continuant à anesthésier et injecter souris).
10. Branchez le lit de la souris à l'oxygène et les lignes isoflurane, et tourner le flux isoflurane sur le lit. Placez un coussin bleu sur le lit.
11. Placez la souris prêt pour la TEP sur le lit, étirant les bras etles jambes et la tenue de cette position avec du ruban adhésif. Placez lubrifiant sur les yeux. Cette étape est la plus cruciale puisque le positionnement de l'animal peut affecter la qualité de votre image.
12. Débrancher les conduites d'isoflurane et de l'oxygène, et monter rapidement le lit de la machine TEP. Placez les lignes isoflurane et de l'oxygène. Assurez-vous que le flux de l'isoflurane est activé pour la machine TEP. Branchez le câble de la TEP et de lancer la numérisation.
13. Une fois que le PET scan est terminé, puis déplacer l'animal au scanner CT. A la suite de cette analyse déplacer l'animal dans sa cage respective.

Representative Results

Un diagramme du processus de transplantation est illustré à la figure 1A. Une image de l'implant ton / liv est montré dans la figure 1B. Le tissu thymique se développe normalement et a une distribution physiologique des humains CD4 et CD8 des lymphocytes T. Après reconstitution, les animaux sont porteurs d'un système immunitaire humain avec une distribution normale des CD4, CD8 des lymphocytes T et d'autres lignées de cellules immunitaires.

L'écart entre la taille de la tumeur et des tissus vivants est montré dans la figure 2. Bien que la tomodensitométrie (zone grise) ont indiqué une croissance importante tumeur in vivo imagerie TEP a montré qu'il était souvent nécrotique et du tissu cicatriciel (figure 2). Cela met en évidence l'utilité de l'imagerie TEP comme un moyen plus sensible et précis pour évaluer la régression tumorale et de libération.

Figure 1. (A) Un schéma sur le modèle BLT modifié utilisé dans ces études pour la génération de souris chimériques portant MART-1 des lymphocytes T spécifiques. L'implant Thy / Liv a été reconstruite à partir de transduites et non transduites CD34 des cellules isolées à partir d'un foie fœtal autologue. Une fraction des cellules transduites est gelé et injectées dans les souris irradiées 4-6 semaines plus tard. (B) Une image représentative de l'implant ton / liv chez des souris humanisées. Les implants ont une distribution tissulaire physiologique et CD4/CD8, comme indiqué par l'IHC et les chiffres de cytométrie en flux. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Une image TEP et CT d'une souris portant une tumeur de mélanome. Lazone grise indique la taille physique de la tumeur tandis que la couleur rouge indique l'activité métabolique de la tumeur, ce qui est très limité.

Discussion

Le modèle modifié BLT souris humanisée associée à l'imagerie TEP in vivo sont des outils puissants pour étudier les maladies chroniques de l'homme. Ce système prend le modèle de souris BLT et elle avance au-delà de la portée limitée de recherche sur le VIH. En outre, il est un grand système dans lequel nous pouvons examiner les divers protocoles de thérapie génique ainsi que des techniques de diagnostic avant qu'ils ne puissent atteindre le milieu clinique. Celui-ci couplée avec le faible coût de l'utilisation de la souris par rapport primates rend ce modèle très utile.

La technologie d'imagerie TEP nous a permis d'évaluer l'efficacité de notre approche. Si l'on s'appuie exclusivement sur des mesures physiques de la tumeur, nous avons sous-estimé la puissance de la réponse anti-tumorale produite par nos cellules T transgéniques. La cicatrisation du tissu nécrotique étendu et a donné l'apparence d'une grosse tumeur, qui était en réalité tissus morts.

En conclusion, l'utilité de la modification m BLT sourisodèle peut être étendue à d'autres modèles de la maladie. Alors que certains inconvénients persistent tels que plus la durée de vie des souris, cela peut être un outil très puissant pour évaluer in vivo de nombreux aspects de l'immunité humaine, de test et de développer de nouvelles interventions thérapeutiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx