Summary

الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ

Published: October 29, 2012
doi:

Summary

تطوير optogenetics يوفر الآن وسيلة لتحفيز الخلايا العصبية بدقة تعريف وراثيا ودوائر، سواء<em> في المختبر</em> و<em> في الجسم الحي</em>. نحن هنا وصف للجمعية وزرع من الألياف البصرية لضوئي مزمن في أنسجة المخ.

Abstract

وكانت أنماط توضيح من اتصالات الخلايا العصبية تحديا لعلم الأعصاب على حد سواء الأساسية والسريرية. وكان معيار الذهب الكهربية لتحليل أنماط الاتصال متشابك، ولكن التسجيلات الكهربية يمكن أن تكون مقترنة مرهقة والحد تجريبيا. وقد أدخلت تطوير optogenetics طريقة لتحفيز الخلايا العصبية أنيقة ودوائر، سواء في المختبر 1 و 2،3 في الجسم الحي. من خلال استغلال خلية من نوع النشاط المروج محددة لدفع السكان في التعبير أوبسين العصبية منفصلة، ​​يمكن للمرء أن تحفز الخلايا العصبية بدقة فرعية محددة وراثيا في دوائر متميزة 4-6. الأساليب المذكورة لتحفيز الخلايا العصبية بشكل جيد، بما في ذلك التحفيز الكهربائي و / أو التلاعب الدوائية، وغالبا ما تكون الخلايا من نوع العشوائي، الغازية، ويمكن أن تلحق الضرر الأنسجة المحيطة بها. يمكن تغيير وظيفة هذه القيود متشابك العادية و / أو السلوك الدائرة. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلكلطبيعة التلاعب، والأساليب المتبعة حاليا في كثير من الأحيان حادة والمحطة الطرفية. Optogenetics يتيح القدرة على تحفيز الخلايا العصبية بطريقة غير ضارة نسبيا، وتستهدف في الخلايا العصبية وراثيا. معظم الدراسات التي تنطوي على استخدام الجسم الحي في optogenetics حاليا الألياف البصرية من خلال الاسترشاد قنية مزروع 6،7، ولكن القيود المفروضة على هذه الطريقة تشمل تلف أنسجة المخ مع تكرار الإدراج من الألياف البصرية، والكسر المحتمل للألياف داخل قنية. نظرا لحقل يزدهر optogenetics، وهي طريقة أكثر موثوقية من التحفيز المزمن هو ضروري لتسهيل الدراسات طويلة الأجل مع الحد الأدنى من ضمانات تلف الأنسجة. هنا نقدم بروتوكول لدينا تعديل في مادة الفيديو لاستكمال أسلوب فعال وأنيق وصفها في سبارتا وآخرون 8 لتصنيع الألياف البصرية على زرع وتثبيت الدائم على الجمجمة من الفئران تخدير، وكذلك جمعية ليفمقرنة البصرية يربط زرع لمصدر الضوء. عملية الزرع، مرتبطة مع الألياف البصرية إلى ليزر الحالة الصلبة، ويسمح لوسيلة فعالة لphotostimulate مزمنة الدوائر العصبية الوظيفية مع أقل تلف الأنسجة 9 باستخدام، للانفصال الصغيرة، الحبال. تثبيت الدائم للزراعة وتوفر الألياف البصرية متسقة، على المدى الطويل في الدراسات المجراة optogenetic الدوائر العصبية في الفئران، مستيقظا يتصرف 10 مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة.

Protocol

* يتم سرد جميع المواد المصنعة منها جنبا إلى جنب مع و / أو البائعين تحت البروتوكول. 1. جمعية زرع إعداد خليط من الايبوكسي للحرارة قابل للشفاء الألياف البصرية عن طريق إضافة 100 ملغ من تصل…

Discussion

Optogenetics هي تقنية جديدة تسمح قوية غير مسبوقة خلال مراقبة الخلايا العصبية فرعية محددة. يمكن استغلال هذا لتعديل الدوائر العصبية التشريحية بدقة والزمنية، مع تجنب العشوائية من نوع الخلية والآثار الغازية من خلال التحفيز الكهربائي الكهربائي. غرس الألياف البصرية يسمح للتح?…

Acknowledgements

نود أن نعترف بأن وصفت أصلا هذه التقنية من قبل سبارتا وآخرون، 2012 و قد تم تكييفه بسهولة لاستخدامها في المختبر.

Materials

Name of the Reagent or Equipment Company Catalogue # Comments
LC Ferrule Sleeve Precision Fiber Products (PFP) SM-CS125S 1.25 mm ID
FC MM Pre-Assembled Connector PFP MM-CON2004-2300 230 μm Ferrule
Miller FOPD-LC Disc PFP M1-80754 For LC ferrules
Furcation tubing PFP FF9-250 900 μm o.d., 250 μm i.d.
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-1270 127 μm ID Bore
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-2300 230 μm ID Bore
Heat-curable epoxy, hardener and resin PFP ET-353ND-16OZ  
FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk ThorLabs D50-FC For FC ferrules
Digital optical power and Energy Meter ThorLabs PM100D Spectrophotometer
Polishing Pad ThorLabs NRS913 9″ x 13″ 50 Durometer
Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits ThorLabs LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P  
Standard Hard Cladding Multimode Fiber ThorLabs BFL37-200 Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool ThorLabs T10S13 Clad/Coat: 200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA Optical Fiber Polymicro Technologies FVP100110125 High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA
1×1 Fiberoptic Rotary Joint doric lenses FRJ_FC-FC  
Mono Fiberoptic Patchcord doric lenses MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC  
Heat shrink tubing, 1/8 inch Allied Electronics 689-0267  
Heat gun Allied Electronics 972-6966 250 W; 750-800 °F
Cotton tipped applicators Puritan Medical Products Company 806-WC  
VetBond tissue adhesive Fischer Scientific 19-027136  
Flash denture base acrylic Yates Motloid ColdPourPowder+Liq  
BONN Miniature Iris Scissors Integra Miltex 18-1392 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades
Johns Hopkins Bulldog Clamp Integra Miltex 7-290 1-1/2″(3.8 cm), curved
MEGA-Torque Electric Lab Motor Vector EL-S  
Panther Burs-Ball #1 Clarkson Laboratory 77.1006  
Violet Blue Laser System CrystaLaser CK473-050-O Wavelength: 473 nm
Laser Power Supply CrystaLaser CL-2005  
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20  
Probe Fine Science Tools 10140-02  
5″Straight Hemostat Excelta 35-PH  
Vise with weighted base Altex Electronics PAN381  

References

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
  3. Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
  4. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  5. Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
  6. Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  7. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
  8. Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
  9. Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
  10. Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).

Play Video

Cite This Article
Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue. J. Vis. Exp. (68), e50004, doi:10.3791/50004 (2012).

View Video