Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale
Summary
Lo sviluppo di optogenetics ora fornisce i mezzi per stimolare i neuroni geneticamente definiti con precisione e circuiti, sia<em> In vitro</em> E<em> In vivo</em>. Qui si descrive il montaggio e l'impianto di una fibra ottica per fotostimolazione cronica del tessuto cerebrale.
Abstract
Modelli chiarire di connettività neuronale è stata una sfida sia per clinica e di base delle neuroscienze. Elettrofisiologia è stato il gold standard per l'analisi dei modelli di connettività sinaptica, ma accoppiati registrazioni elettrofisiologiche possono essere sia ingombrante e sperimentalmente limitante. Lo sviluppo di optogenetics ha introdotto un metodo elegante per stimolare i neuroni e circuiti, sia in vitro che in vivo 1 e 2,3. Sfruttando cellula-tipo di attività specifica promotore per guidare l'espressione opsin in discrete popolazioni di neuroni, si può stimolare con precisione geneticamente definiti sottotipi neuronali distinti circuiti 4-6. Metodi ben descritti per stimolare neuroni, compresi stimolazione elettrica e / o manipolazioni farmacologiche, sono spesso del tipo cellulare indiscriminata, invasivo, e può danneggiare i tessuti circostanti. Queste limitazioni possono alterare la normale funzione sinaptica e / o di comportamento del circuito. Inoltre, a causaalla natura della manipolazione, i metodi attuali sono spesso acuta e terminale. Optogenetics offre la capacità di stimolare i neuroni in modo relativamente innocuo, e nei neuroni geneticamente mirati. La maggior parte degli studi riguardanti optogenetics in vivo attualmente utilizza una fibra ottica guidato attraverso una cannula impiantata 6,7, tuttavia, le limitazioni di questo metodo includono tessuto cerebrale danneggiato con inserimento ripetuto di una fibra ottica, e una possibile rottura della fibra all'interno della cannula. Dato il campo in rapida crescita della optogenetics, un metodo più affidabile di stimolazione cronica è necessaria per facilitare studi a lungo termine con il minimo danno tissutale collaterali. Qui forniamo il nostro protocollo modificato come video articolo per integrare il metodo efficace ed elegantemente descritto in Sparta et al. 8 per la realizzazione di un impianto in fibra ottica e la sua fissazione permanente sul cranio di topi anestetizzati, così come l'assemblaggio del fibraaccoppiatore ottico collega l'impianto di una fonte di luce. L'impianto, collegato con fibre ottiche ad un laser a stato solido, permette un metodo efficiente per photostimulate cronicamente funzionale circuiteria neuronale con danno tissutale meno 9 utilizzando piccoli, staccabili, cavezze. Fissaggio permanente degli impianti in fibra ottica provvede a mantenere a lungo termine in vivo studi optogenetic di circuiti neuronali in Svegliatevi, topi si comportano 10 con minimo danno tissutale.
Protocol
Discussion
Optogenetics è una tecnica nuova e potente che consente il controllo senza precedenti su specifici sottotipi neuronali. Ciò può essere sfruttato per modulare circuiti neurali con precisione anatomica e temporale, evitando il tipo cellulare e indiscriminata effetti invasivi di stimolazione elettrica attraverso un elettrodo. L'impianto di fibre ottiche permette di coerenza, stimolazione cronica dei circuiti neurali più sessioni in sveglio, comportandosi topi con il minimo danno al tessuto. Questo sistema, originar…
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere che questa tecnica è stata originariamente descritta da Sparta et al., 2012 ed è stato facilmente adattato per l'uso nel nostro laboratorio.
Materials
| Name of the Reagent or Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9″ x 13″ 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1×1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2″(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5″Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
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