Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral
Summary
O desenvolvimento de Optogenetics agora fornece os meios para estimular precisamente neurônios geneticamente definidas e circuitos, tanto<em> In vitro</em> E<em> In vivo</em>. Aqui, descrevemos a montagem e implantação de uma fibra óptica para fotoestimulação crônica do tecido cerebral.
Abstract
Elucidando padrões de conectividade neuronal tem sido um desafio para a neurociência clínica e básica. Eletrofisiologia tem sido o padrão ouro para analisar padrões de conectividade sináptica, mas emparelhados registros eletrofisiológicos pode ser tanto complicado e experimentalmente limitante. O desenvolvimento de Optogenetics introduziu um método elegante para estimular os neurónios e circuitos, tanto in vitro e in vivo 1 2,3. Ao explorar tipo de célula-atividade do promotor específico para dirigir a expressão opsina em discretos populações neuronais, pode-se precisamente estimular geneticamente definidas subtipos neuronais em circuitos distintos 4-6. Métodos bem descritos para estimular os neurônios, incluindo a estimulação elétrica e / ou manipulações farmacológicas, são muitas vezes de células do tipo indiscriminada, invasivo e pode danificar os tecidos circundantes. Estas limitações podem alterar a função sináptica normal e / ou o comportamento do circuito. Além disso, devidoa natureza da manipulação, os métodos actuais são, muitas vezes aguda e terminal. Optogenetics proporciona a capacidade de estimular os neurónios de uma maneira relativamente inócua, e em neurónios alvo geneticamente. A maioria dos estudos in vivo envolvendo em Optogenetics actualmente utilizar uma fibra óptica guiada através de uma cânula implantada 6,7, no entanto, limitações deste método incluem o tecido cerebral danificado com inserção repetida de uma fibra óptica, e quebra potencial da fibra no interior da cânula. Dada a florescente campo de optogenética, um método mais confiável de estimulação crônica é necessária para facilitar estudos de longo prazo com o mínimo de danos colaterais tecido. Aqui nós fornecemos nosso protocolo modificado tal como um artigo de vídeo para complementar o método eficaz e elegante descrito em Sparta et al. 8 para o fabrico de um implante de fibra óptica e a sua fixação permanente sobre o crânio de ratos anestesiados, assim como a montagem do fibraacoplador óptico de ligar o implante a uma fonte de luz. O implante, conectado com fibras ópticas a um laser de estado sólido, permite um método eficiente para cronicamente photostimulate circuito neuronal funcional com menos danos do tecido 9 usando pequenos destacáveis, amarras. Fixação permanente dos implantes de fibra óptica fornece consistentes, a longo prazo, em estudos in vivo optogenética de circuitos neuronais em ratos acordados, comportando 10 a uma lesão tecidual mínima.
Protocol
Discussion
Optogenética é uma nova e poderosa técnica que permite o controle sem precedentes sobre subtipos específicos de neurônios. Isto pode ser explorado para modular os circuitos neurais com precisão anatómica e temporal, evitando ao mesmo tempo o tipo de célula indiscriminada e efeitos invasivas de estimulação eléctrica através de um eléctrodo. O implante de fibras ópticas permite uma estimulação consistente e crónica dos circuitos neurais mais sessões múltiplas em desperto, comportando camundongos com dan…
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer que esta técnica foi descrita originalmente por Sparta et al., 2012 e foi facilmente adaptado para uso em nosso laboratório.
Materials
| Name of the Reagent or Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9″ x 13″ 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1×1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2″(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5″Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
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