Summary

La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Published: October 29, 2012
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Summary

El desarrollo de optogenética ahora proporciona el medio para estimular las neuronas precisamente definidos genéticamente y circuitos, ambos<em> In vitro</em> Y<em> In vivo</em>. Aquí se describe el montaje y la implantación de una fibra óptica para la fotoestimulación crónica del tejido cerebral.

Abstract

Elucidar los patrones de conectividad neuronal ha sido un reto tanto para la neurociencia básica y clínica. Electrofisiología ha sido el estándar de oro para el análisis de los patrones de conectividad sináptica, pero emparejados registros electrofisiológicos puede ser a la vez engorroso y limitar experimentalmente. El desarrollo de optogenética ha introducido un método elegante para estimular las neuronas y circuitos, tanto in vitro como in vivo 1 y 2,3. Mediante la explotación de células de tipo actividad promotora específica para conducir la expresión de opsina en poblaciones neuronales discretas, uno precisamente puede estimular genéticamente definidos subtipos neuronales en circuitos distintos 4-6. Métodos bien descritos para estimular las neuronas, incluyendo la estimulación eléctrica y / o manipulaciones farmacológicas, son a menudo de tipo celular indiscriminada, invasiva, y puede dañar los tejidos circundantes. Estas limitaciones podrían alterar la función normal sináptica y / o comportamiento del circuito. Además, debidoa la naturaleza de la manipulación, los métodos actuales son a menudo aguda y terminal. Optogenética proporciona la capacidad de estimular las neuronas de una manera relativamente inocuo, y en las neuronas genéticamente dirigidos. La mayoría de los estudios que implican en optogenética in vivo actualmente utiliza una fibra óptica de guía a través de una cánula implantada 6,7, sin embargo, las limitaciones de este método incluyen tejido dañado cerebro con la inserción repetida de una fibra óptica, y la rotura potencial de la fibra en el interior de la cánula. Dado el creciente campo de la optogenética, un método más fiable de la estimulación crónica es necesario para facilitar estudios a largo plazo con el mínimo daño tisular colateral. Aquí nos proporcionan nuestro protocolo modificado como un artículo de vídeo para complementar el método eficaz y elegantemente descrito en Sparta et al. 8 para la fabricación de un implante de fibra óptica y su fijación permanente en el cráneo de ratones anestesiados, así como el montaje de la fibraacoplador óptico de conectar el implante a una fuente de luz. El implante, conectado con fibras ópticas a un láser de estado sólido, permite un método eficiente para photostimulate crónicamente circuitería neuronal funcional con menos daño al tejido 9, usando pequeñas correas desmontables,. Fijación permanente de los implantes de fibra óptica proporciona coherente, a largo plazo in vivo en estudios optogenético de los circuitos neuronales en ratones despiertos, comportándose 10 con el daño tisular mínima.

Protocol

* Todos los materiales, junto con los respectivos fabricantes y / o proveedores se enumeran a continuación el protocolo. 1. Asamblea de los implantes Preparar una mezcla de epoxi curable por calor de fibra óptica mediante la adición de 100 mg de catalizador a 1 g de resina. Mida y corte aproximadamente 35 mm de fibra óptica de 125 micras con núcleo de 100 micras al anotar con un escribano de cuña punta de carburo. Coloque el escribano perpendicular a la fibra ópti…

Discussion

Optogenética es una técnica nueva y potente que permite un control sin precedentes sobre determinados subtipos neuronales. Esto puede explotarse para modular los circuitos neuronales con precisión anatómica y temporal, evitando al mismo tiempo la indiscriminada de tipo celular y efectos invasivos de la estimulación eléctrica a través de un electrodo. La implantación de la fibra óptica permite la estimulación consistente, crónica de los circuitos neuronales en varias sesiones en despierto, comportándose raton…

Acknowledgements

Nos gustaría reconocer que esta técnica fue descrita originalmente por Esparta et al., 2012, y ha sido fácilmente adaptado para su uso en nuestro laboratorio.

Materials

Name of the Reagent or Equipment Company Catalogue # Comments
LC Ferrule Sleeve Precision Fiber Products (PFP) SM-CS125S 1.25 mm ID
FC MM Pre-Assembled Connector PFP MM-CON2004-2300 230 μm Ferrule
Miller FOPD-LC Disc PFP M1-80754 For LC ferrules
Furcation tubing PFP FF9-250 900 μm o.d., 250 μm i.d.
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-1270 127 μm ID Bore
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-2300 230 μm ID Bore
Heat-curable epoxy, hardener and resin PFP ET-353ND-16OZ  
FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk ThorLabs D50-FC For FC ferrules
Digital optical power and Energy Meter ThorLabs PM100D Spectrophotometer
Polishing Pad ThorLabs NRS913 9″ x 13″ 50 Durometer
Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits ThorLabs LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P  
Standard Hard Cladding Multimode Fiber ThorLabs BFL37-200 Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool ThorLabs T10S13 Clad/Coat: 200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA Optical Fiber Polymicro Technologies FVP100110125 High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA
1×1 Fiberoptic Rotary Joint doric lenses FRJ_FC-FC  
Mono Fiberoptic Patchcord doric lenses MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC  
Heat shrink tubing, 1/8 inch Allied Electronics 689-0267  
Heat gun Allied Electronics 972-6966 250 W; 750-800 °F
Cotton tipped applicators Puritan Medical Products Company 806-WC  
VetBond tissue adhesive Fischer Scientific 19-027136  
Flash denture base acrylic Yates Motloid ColdPourPowder+Liq  
BONN Miniature Iris Scissors Integra Miltex 18-1392 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades
Johns Hopkins Bulldog Clamp Integra Miltex 7-290 1-1/2″(3.8 cm), curved
MEGA-Torque Electric Lab Motor Vector EL-S  
Panther Burs-Ball #1 Clarkson Laboratory 77.1006  
Violet Blue Laser System CrystaLaser CK473-050-O Wavelength: 473 nm
Laser Power Supply CrystaLaser CL-2005  
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20  
Probe Fine Science Tools 10140-02  
5″Straight Hemostat Excelta 35-PH  
Vise with weighted base Altex Electronics PAN381  

References

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
  3. Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
  4. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  5. Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
  6. Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  7. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
  8. Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
  9. Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
  10. Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).

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Cite This Article
Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue. J. Vis. Exp. (68), e50004, doi:10.3791/50004 (2012).

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