Summary

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Published: June 23, 2013
doi:

Summary

نحن تصف طريقة التصوير الخلية الحية التي توفر نظرة ثاقبة ديناميات البروتين أثناء عملية التنشيط تي خلية. ونحن لشرح الاستخدام المشترك لتي خلية نشر الفحص، الفحص المجهري متحد البؤر وتحليل التصوير أن تسفر النتائج الكمية لمتابعة إشارات تشكيل المعقدة في جميع أنحاء تي خلية التنشيط.

Abstract

وتتوسط حماية ضد الأمراض المعدية من قبل 1،2 الجهاز المناعي. الخلايا اللمفية تي هي المنسقين ماجستير في الجهاز المناعي، وتنظيم وتفعيل والاستجابات من الخلايا المناعية متعددة 3،4. تي خلية التنشيط يعتمد على الاعتراف مستضدات محددة المعروضة بواسطة خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). مستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCR) الخاصة بكل استنساخ خلايا T ويحدد مستضد خصوصية 5. الربط من TCR للمستضد الحث على الفسفرة من مكونات مجمع TCR. من أجل تعزيز تي خلية التنشيط، يجب ترانسدوسيد هذه إشارة من الغشاء إلى السيتوبلازم والنواة، وبدء مختلف الاستجابات حاسمة مثل تجنيد يشير البروتينات إلى TCR؛ موقع APC (المشبك المناعي)، وتفعيل الجزيئية، إعادة ترتيب هيكل الخلية، ارتفاع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، والتغيرات في التعبير الجيني 6،7. الصحيح فيitiation وإنهاء الإشارات تفعيل أمر حاسم لتي خلية الاستجابات المناسبة. النشاط من البروتينات مما يشير يعتمد على تشكيل وإنهاء البروتين البروتين التفاعلات، إضافة التعديلات متعدية مثل الفسفرة البروتين، وتشكيل المجمعات البروتين، ubiquitylation البروتين وتجنيد البروتينات لمختلف المواقع الخلوية 8. فهم الأعمال الداخلية للعملية التنشيط تي خلية أمر بالغ الأهمية لكلا البحوث المناعية والتطبيقات السريرية.

وقد وضعت فحوصات مختلفة من أجل تحقيق البروتين البروتين التفاعلات، ولكن فحوصات الكيمياء الحيوية، مثل المستخدمة على نطاق واسع طريقة التعاون للمناعي، لا تسمح الموقع البروتين يمكن أن يلاحظ، مما يحول دون مراقبة من معلومات قيمة حول ديناميات الخلوية الآليات. بالإضافة إلى ذلك، معظم هذه المقايسات عادة الجمع بين البروتينات من العديد من الخلايا المختلفة التي قد تكون في مراحل مختلفة من رانه عملية التحقيق الخلوية. هذا يمكن أن يكون لها تأثير ضار على القرار الزماني. استخدام التصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا الحية يسمح كل من تتبع المكانية للبروتينات والقدرة على التمييز بين الأحداث يشير زمنيا، وبالتالي تسليط الضوء على ديناميات العملية 9،10. فإننا نقدم وسيلة من التصوير في الوقت الحقيقي من تشكيل الإشارات المعقدة خلال تفعيل الخلايا التائية. و transfected الأولية خلايا T أو T-خطوط الخلية، مثل Jurkat، مع البلازميدات ترميز للبروتينات ذات الاهتمام تنصهر إلى البروتينات الفلورية أحادى، ومنع oligomerization غير الفسيولوجية 11. يتم إسقاط تعيش خلايا تي خلال ساترة قبل المغلفة مع الأجسام المضادة الخلايا T-تفعيل 8،9، الذي يربط المجمع CD3/TCR، الأمر الذي أدى تنشيط خلايا T في حين التغلب على ضرورة تفعيل مستضدات محددة. يتم تصوير الخلايا تفعيلها باستمرار مع استخدام الفحص المجهري متحد البؤر. ويتم تحليل البيانات التصوير أن تسفر النتائج الكمية، مثل عمودمعامل ocalization من البروتينات الإشارة.

Protocol

1. ترنسفكأيشن خلايا T إعداد المنشط الحل Nucleofector Amaxa عن طريق خلط حل "الملحق" عدة إلى الحل Nucleofector. قد يتم تخزين الحل تفعيلها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. تنمو الخلايا التائية Jurkat ?…

Representative Results

نقدم مثالا لايف التصوير T-خلية والتحليل. قبل التجربة والتصوير، وقد تم تحليل SLP76 خلايا T ناقص (J14) مع استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحديد التعبير عن البروتينات الفلورية (الشكل 1). أودعت خلايا T transfected مع البروتينات إشارات الموسومة MCFP-NCK وSLP76-mYFP أكثر الشرائ?…

Discussion

تنظيم وظيفة من العمليات الخلوية متعددة تعتمد على تشكيل وإنهاء البروتين البروتين التفاعلات. التصوير المجهري يسمح تتبع في الوقت الحقيقي من البروتينات الموسومة fluorescently في الخلايا الحية. Colocalization من البروتينات الموسومة يمكن أن تشير إلى التفاعل المباشر أو غير المباشر بي…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفان بالشكر صوفيا فرايد للحصول على المساعدة الفنية. MBS يشكر الجهات التالية للحصول على دعم أبحاثهم: مؤسسة العلوم الإسرائيلية للحصول على منح no.1659/08، 971/08، 1503-1508 و 491/10، وزارتي الصحة والعلوم للحصول على منح لا. 3-4114 3-6540 و، وجمعية السرطان اسرائيل من خلال تركة الراحل الكسندر Smidoda، ومؤسسة أسرة Taubenblatt للحصول على منحة التميز الادوية الحيوية.

Materials

Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002  
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432  
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058  
FCS HyClone SV30160.03  
G418 Calbiochem 345810  
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382  
HCl Bio Lab 8410501  
Hepes Biological Industries 03-025-1B  
Hygromycin Enzo ALX-380-306  
L-glutamine Sigma G7513  
PBS (10X) Sigma D1408  
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781  
Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O Sigma P8920  
RPMI Sigma R8758  
Sodium azide Sigma S2002  
Equipment      
Accublock digital dry bath Labnet D1105A  
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R  
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta  
Heatable mounting frame – Heating Insert P S PeCon 130-800-031  
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000  
Electroporation device Amaxa Nucleofector I  
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE  
Image analysis software Bitplane 7.0.0  

References

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).

Play Video

Cite This Article
Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

View Video