Summary

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Published: June 23, 2013
doi:

Summary

我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。

Abstract

感染症に対する防御を、免疫系1,2によって媒介される。 Tリンパ球は、3,4、複数の免疫細胞の活性化および応答を調節、免疫系のマスターコーディネーターである。 T細胞活性化は、抗原提示細胞(APC)によって表示される特定の抗原の認識に依存する。 T細胞抗原受容体(TCR)は、各T細胞クローンに固有のもので、抗原特異性5を決定します。抗原への結合は、TCR TCR複合体の成分のリン酸化を誘導する。 T細胞の活性化を促進するために、この信号は、TCRにシグナル伝達タンパク質の補充などの様々な重大な反応を開始する、膜から細胞質及び核に導入されなければならない。APCサイト(免疫シナプス)、それらの分子の活性化は、細胞骨格の再配列、細胞内カルシウム濃度の上昇、および遺伝子発現の変化6,7。で正しい活性化シグナルのitiationと終了は、適切なT細胞応答のために重要です。シグナル伝達タンパク質の活性は、タンパク質-タンパク質相互作用の形成および終端に依存する、例えば、タンパク質リン酸化、タンパク質複合体、タンパク質のユビキチン化および種々の細胞のサイト8へのタンパク質の動員の形成などの翻訳後修飾を書き込む。 T細胞活性化プロセスの内部の仕組みを理解することは免疫学研究と臨床応用の両方に重要です。

種々のアッセイは、タンパク質 – タンパク質相互作用を調査するために開発されてきたが、そのような広く使用されている免疫共沈降法などの生化学的アッセイは、タンパク質の位置を識別することができないように、従って、細胞の動態に貴重な洞察の観察を排除メカニズム。さらに、これらのアッセイは、通常、バルク、tのさまざまな段階であるかもしれない多くの異なる細胞からのタンパク質を結合する彼は、細胞のプロセスを検討した。これは、時間分解能に悪影響を及ぼすことができます。生細胞のリアルタイムイメージングの使用は、従って、プロセス9,10のダイナミクスに光を当て、タンパク質の空間時間的に追跡およびシグナル伝達事象を区別する能力の両方を可能にする。我々は、T細胞活性化の間のシグナル伝達複合体形成のリアルタイムイメージングの方法を提案する。一次T細胞又は例えばJurkat細胞などのT細胞ラインは、非生理的なオリゴマー11を予防、単量体蛍光タンパク質に融合された関心のあるタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされる。フォトT細胞は、抗原特異的活性化の必要性を克服しながら、T細胞活性化を誘導し、CD3/TCR複合体に結合し、T細胞活性化抗体8,9、カバースリップでプレコートされた上でドロップされる。活性化細胞は常に共焦点顕微鏡を用いて結像​​される。撮像データは、コルなどの定量結果を得るために分析されるシグナル伝達タンパク質のocalization係数。

Protocol

1。 T細胞トランスフェクションクレオソリューションにキットの "サプリメント"溶液を混合することによって活性化Amaxaヌクレオソリューションを準備します。活性化する溶液を4℃で3ヶ月までの℃で保存することができる。 [10%ウシ胎児血清(FCS)、1%ペニシリン – ストレプトマイシン溶液、及びRPMI中の2mMのL-グルタミン]培地でジャーカットT細胞を成長させる。最?…

Representative Results

我々は、ライブT細胞イメージングと解析例を提示する。撮像実験に先立ち、SLP76欠損T細胞(J14)は、蛍光タンパク質( 図1)の発現を決定するために、FACSを用いて分析した。タグ付けされたシグナル伝達タンパク質mCFP-NckのSLP76と、mYFPでトランスフェクトしたT細胞を活性化するスライド上に堆積され、T細胞拡散( 図2)の間に画像化した。収集された画像は、活性?…

Discussion

複数の細胞プロセスの制御と機能は、タンパク質 – タンパク質相互作用の形成および終了に依存する。顕微鏡イメージングは​​、生きている細胞内の蛍光標識タンパク質のリアルタイム追跡を可能にします。タグ融合タンパク質の共局在は、タンパク質間の直接的または間接的な相互作用を示唆することができ、例えば、免疫沈降などの生化学的方法によって得られた知見を補強するため?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、技術支援のためにソフィアフライドに感謝します。助成no.1659/08、971/08、1503年から1508年と10分の491、無助成金健康科学の各省庁のためにイスラエル科学財団:MBSは、研究支援のために、次の機関に感謝します。 3から4114まで及び3から6540まで、後期アレクサンダーSmidodaの不動産を通じてイスラエル癌学会、およびバイオ医学の優秀付与Taubenblattファミリー財団。

Materials

Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002  
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432  
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058  
FCS HyClone SV30160.03  
G418 Calbiochem 345810  
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382  
HCl Bio Lab 8410501  
Hepes Biological Industries 03-025-1B  
Hygromycin Enzo ALX-380-306  
L-glutamine Sigma G7513  
PBS (10X) Sigma D1408  
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781  
Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O Sigma P8920  
RPMI Sigma R8758  
Sodium azide Sigma S2002  
Equipment      
Accublock digital dry bath Labnet D1105A  
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R  
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta  
Heatable mounting frame – Heating Insert P S PeCon 130-800-031  
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000  
Electroporation device Amaxa Nucleofector I  
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE  
Image analysis software Bitplane 7.0.0  

References

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).

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Cite This Article
Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

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