Summary

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Published: June 23, 2013
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Abstract

Schutz gegen Infektionskrankheiten durch das Immunsystem vermittelt 1,2. T-Lymphozyten sind die Master Koordinatoren des Immunsystems, der Regulierung der Aktivierung und Antworten mehrerer Immunzellen 3,4. T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Erkennung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) angezeigt. Die T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR) ist spezifisch für jedes T-Zell-Klon und bestimmt Antigenspezifität 5. Die Bindung des TCR auf das Antigen induziert die Phosphorylierung von Komponenten des TCR-Komplexes. Um den T-Zell-Aktivierung zu fördern, müssen dieses Signal von der Membran in das Zytoplasma und den Zellkern transduziert Einleiten verschiedenen entscheidenden Reaktionen wie Einstellung der Signal-Proteinen an die TCR; APC Website (Immunsynapse), deren molekulare Aktivierung Zytoskelett-Umlagerung Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration, und Veränderungen in der Genexpression 6,7. Die richtige initiation und Beendigung der Aktivierungssignale ist entscheidend für die entsprechenden T-Zell-Reaktionen. Die Aktivität der Signalproteine ​​ist abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung die Bildung von Protein-Komplexe, Protein Ubiquitin und die Rekrutierung von Proteinen an verschiedenen zellulären Seiten 8. Das Verständnis, das Innenleben des T-Zell-Aktivierung ist entscheidend sowohl für die immunologische Forschung und klinische Anwendungen.

Verschiedene Tests wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, aber biochemische Assays, wie dem weit verbreiteten Co-Immunopräzipitation Methode nicht zulassen Protein Lage zu sein, erkannt und somit auch keine Beobachtung wertvolle Einblicke in die Dynamik zellulärer Mechanismen. Zusätzlich können diese Masse Assays kombinieren üblicherweise Proteine ​​aus verschiedenen Zellen, die möglicherweise in verschiedenen Stadien der ter untersucht zellulären Prozess. Dies kann sich nachteilig auf die zeitliche Auflösung. Die Verwendung von Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen ermöglicht sowohl die räumliche Verfolgung von Proteinen und die Fähigkeit, zeitlich zwischen Signalwege zu unterscheiden, damit Licht auf die Dynamik des Prozesses 9,10. Wir stellen ein Verfahren zur Echtzeit-Bildgebung von Signalisierungs-Komplexbildung bei T-Zell-Aktivierung. Primären T-Zellen oder T-Zell-Linien, wie Jurkat sind mit Plasmiden, die für Proteine ​​von Interesse fusioniert an monomeren fluoreszierenden Proteine ​​transfiziert verhindert unphysiologische Oligomerisierung 11. Live-T-Zellen werden in einem Deckglas vorbeschichtet mit T-Zell-aktivierende Antikörper 8,9, die dem CD3/TCR Komplex bindet und induziert T-Zell-Aktivierung unter Überwindung der Bedarf an speziellen aktivierende Antigene fallen gelassen. Aktivierten Zellen werden ständig mit der Verwendung der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Imaging Daten werden analysiert, um quantitative Ergebnisse, wie die Ausbeute colocalization Koeffizient der Signal-Proteinen.

Protocol

1. T-Zell-Transfektion Bereiten Sie die aktivierten Amaxa Nucleofector Lösung durch Mischen des Kits "Nachtrag" Lösung des Nucleofector Lösung. Die aktivierte Lösung kann bei 4 ° C für bis zu drei Monate gelagert werden. Wachsen Jurkat-T-Zellen in Kulturmedium [10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 2 mM L-Glutamin in RPMI]. Optimalerweise sollten die Zellen 1-2 Wochen nach dem Auftauen verwendet werden. Mit Zellkulturen in der logarithmischen Wachstu…

Representative Results

Wir präsentieren ein Beispiel für Live-T-Zell-Bildgebung und Analyse. Vor dem Imaging Experiment wurden SLP76 defizienten T-Zellen (J14) mit der Verwendung von FACS auf die Expression der fluoreszierenden Proteine ​​(Abbildung 1) zu bestimmen, analysiert. T-Zellen mit den markierten Signalproteine ​​MCFP-Nck und SLP76-mYFP transfiziert wurden Aktivieren Folien aufgebracht und abgebildet während T-Zell-Spreizung (Abbildung 2). Gesammelte Bilder zeigen die Dynamik von Protein-L…

Discussion

Die Regulation und Funktion von mehreren zellulären Prozessen abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Interaktionen. Mikroskopische Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Tracking von fluoreszierend markierten Proteinen in lebenden Zellen. Kolokalisation markierter Proteine ​​deuten auf eine direkte oder indirekte Wechselwirkung zwischen den Proteinen und kann verwendet werden, um Erkenntnisse durch biochemische Methoden wie Immunpräzipitation erhalten verstärken. Im Gegensatz zu biochemischen M…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Sophia Fried für die technische Unterstützung. MBS dankt den folgenden Organisationen für ihre Unterstützung der Forschung: Die Israel Science Foundation für Finanzhilfen no.1659/08, 971/08 1503/08 und 491/10, die Ministerien für Gesundheit & Science Zuschüsse Nr. 3-4114 und 3-6540, die Israel Cancer Association durch das Anwesen des verstorbenen Alexander Smidoda und die Taubenblatt Family Foundation für die Bio-Medizin Exzellenz Zuschuss.

Materials

Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002  
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432  
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058  
FCS HyClone SV30160.03  
G418 Calbiochem 345810  
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382  
HCl Bio Lab 8410501  
Hepes Biological Industries 03-025-1B  
Hygromycin Enzo ALX-380-306  
L-glutamine Sigma G7513  
PBS (10X) Sigma D1408  
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781  
Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O Sigma P8920  
RPMI Sigma R8758  
Sodium azide Sigma S2002  
Equipment      
Accublock digital dry bath Labnet D1105A  
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R  
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta  
Heatable mounting frame – Heating Insert P S PeCon 130-800-031  
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000  
Electroporation device Amaxa Nucleofector I  
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE  
Image analysis software Bitplane 7.0.0  

References

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Cite This Article
Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

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