T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal
Summary
Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.
Abstract
Bulaşıcı hastalıklara karşı koruma bağışıklık sistemi 1,2 aracılık eder. T lenfositleri birden fazla bağışıklık hücrelerinin 3,4 aktivasyonu ve yanıtları düzenleyen, bağışıklık sisteminin ana koordinatör vardır. T-hücresi aktivasyonu antijen sunan hücreler (APC) tarafından gösterilen spesifik antijen tanınması bağlıdır. T-hücresi antijen reseptörü (TCR), her T-hücresi klonu özgüdür ve antijen özgüllüğü 5 belirler. Antijene TCR bağlayıcı TCR kompleksinin bileşenlerinin fosforilasyonu neden olur. T-hücresi aktivasyonunu teşvik etmek için, bu sinyali gibi TCR proteinlerin sinyal alımı gibi çeşitli önemli tepkiler başlatarak, zardan sitoplazma ve çekirdeğe transduse olmalıdır, APC Alanı (bağışıklık sinaps), molekül aktivasyonu, sitoskeletal düzenlenmesi, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun yükselmesi ve gen ekspresyonu 6,7 değişiklikler. Doğruaktive sinyallerin itiation ve sonlandırılması uygun T hücre yanıtları için çok önemlidir. Sinyal proteinlerinin aktivitesi protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır, bu tür protein fosforilasyonu, protein kompleksleri, ve protein ubiquitylation çeşitli hücresel sitelerinin 8 proteinlerin işe oluşumu gibi translasyon sonrası modifikasyonlar. T-hücre aktivasyonu sürecinin iç işleyişini anlamak immünolojik araştırma ve klinik uygulamaları için çok önemlidir.
Çeşitli testler protein-protein etkileşimleri araştırmak için geliştirilmiştir, ancak bu yaygın olarak kullanılan ortak immunoprecipitation yöntemi olarak biyokimyasal testleri, böylece hücresel dinamikleri içine değerli bilgiler gözlem engelleyen, protein konumu ayırt izin yok mekanizmaları. Ayrıca, bu toplu testlerin genellikle t farklı aşamalarında olabilir birçok farklı hücrelerden protein birleştirmeko hücresel süreci incelenmiştir. Bu zamansal çözünürlüğe üzerinde zararlı etkisi olabilir. Canlı hücrelerin gerçek zamanlı görüntülemenin kullanımı dolayısıyla sürecin 9,10 dinamikleri üzerinde ışık tutan, proteinlerin mekansal izleme ve geçici olarak sinyal olayları birbirinden ayırt etmek yeteneği hem de sağlar. Biz T-hücre aktivasyonu sırasında sinyal-kompleks oluşumunun gerçek zamanlı görüntüleme bir yöntem mevcut. Primer T-hücreleri veya bu gibi Jurkat T-hücre, fizyolojik olmayan bir oligomerizasyon 11 önlenmesi, monomer cinsi floresan proteinleri ile kaynaşmış ilgi proteinleri için kodlayan plazmid ile transfekte edilir. • Canlı hücreler, spesifik antijen için aktive ihtiyacının üstesinden gelinir ise T-hücresi aktivasyonunu uyaran, CD3/TCR kompleksine bağlanan T-hücresi aktive edici antikor 8,9, bir lamel ile önceden kaplanmış üzerinde bırakılır. Aktif hücreleri sürekli konfokal mikroskopi kullanımı ile görüntülü. Görüntüleme veriler, col gibi kantitatif sonuçlar, verim için analiz edilirsinyal proteinlerinin ocalization katsayısı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çoklu hücresel süreçlerin düzenlenmesi ve fonksiyonu protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır. Mikroskobik görüntüleme canlı hücrelerde floresan etiketli proteinlerin gerçek zamanlı izleme sağlar. Işaretlenmiş olan proteinlerin ko proteinler arasında doğrudan veya dolaylı olarak etkileşime önerebilir ve bu immüno-çökeltme gibi biyokimyasal yöntemler ile elde edilen bulguların güçlendirmek için kullanılabilir. Biyokimyasal yöntemler farklı olarak, canlı hücre g?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik yardım için Sophia Fried teşekkür ederim. Hibe no.1659/08, 971/08 1503/08 491/10, hiçbir hibe Sağlık ve Bilim Bakanlıkları için İsrail Bilim Vakfı: MBS araştırma destek için aşağıdaki kurumlar teşekkür. 3-4.114 ve 3-6.540, geç Alexander Smidoda ve Emlak aracılığıyla İsrail Kanser Derneği ve Bio-tıp mükemmellik hibe için Taubenblatt Aile Vakfı.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
